紫外可見光譜法探討白藜蘆醇的穩定性和反應性能

李邦玉+朱曉巧+仇雪玲

摘要：為了考察白藜蘆醇在多種體系中的穩定性和反應性能，采用紫外可見分光光度法定性研究溫度、時間、紫外線和溶劑等對白藜蘆醇穩定性的影響，跟蹤白藜蘆醇分別與酸堿、H2O2、DPPH·、銅離子的反應。結果表明：溫度、時間、紫外線等都不同程度影響白藜蘆醇的穩定性，紫外可見光譜跟蹤到了酸堿、H2O2、DPPH·和白藜蘆醇的反應。

關鍵詞：白藜蘆醇；穩定性；反應性；紫外可見分光光度法

中圖分類號： TS201.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0302-03

研究發現，最初從毛葉藜醇中發現的白藜蘆醇（resveratrol）是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保護以及神經系統保護等多種生理功效，同時在功能食品和化妝品方面具有很好的應用價值[1]。但是天然多酚類化合物不穩定，曹庸等曾經研究了純白藜蘆醇在加熱和光照下的穩定性，并用HPLC法測定了虎杖中白藜蘆醇含量[2]。鄭湘娟等用HPLC 法考察了在提取液中白藜蘆醇的穩定性，初步獲得了能夠基本保持白藜蘆醇穩定的最佳提取工藝條件[3]。本試驗擬采用紫外可見分光光度法，更全面地定性研究不同條件下白藜蘆醇的穩定性及其與酸堿、H2O2、DPPH·、銅離子等的反應。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇（南京廣潤生物生物制品，98%），DPPH·（Sigma公司），無水乙醇，30%過氧化氫，鹽酸，氫氧化鈉，甲醇、乙腈、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、己烷等藥品皆為國產分析純試劑。

紫外可見分光光度計（型號：UV-1801），十萬分之一天平（CPA 225D），電熱恒溫水浴鍋，三用紫外分析儀（WFH-203），上海精科實業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃度對白藜蘆醇的影響 準確稱取白藜蘆醇 0.042 0 g 于250 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容，得 168 μg/mL 的白藜蘆醇儲備液。用移液管分別移取白藜蘆醇儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于25 mL的比色管中，用無水乙醇定容至10 mL配成濃度為1.68、3.36、5.04、6.72、8.40、10.08 μg/mL的梯度溶液，用UV-Vis光譜儀進行光譜檢測。

1.2.2 溫度對白藜蘆醇溶液的影響 分別吸取濃度為 168 μg/mL 的白藜蘆醇儲備液0.2 mL于6支25 mL比色管中，用無水乙醇定容到10 mL，配成等濃度的溶液，分別放入冰箱（4 ℃）、室溫（20 ℃）、40、60、80 ℃溫度的水浴鍋中各 1 h 后取出，用UV-Vis光譜儀進行光譜檢測。

1.2.3 時間對白藜蘆醇溶液的影響 分別吸取濃度為 168 μg/mL 的白藜蘆醇儲備液0.2 mL于7支25 mL比色管中，用無水乙醇定容到10 mL，將其中6支比色管放入80 ℃水浴鍋中，分別在0.5、1.0、2.0、3.0、4.5、5.5 h后掃描其紫外可見吸收曲線。

1.2.4 紫外燈照射對白藜蘆醇溶液的影響 分別吸取濃度為168 μg/mL的白藜蘆醇儲備液0.2 mL于9支25 mL比色管中，用無水乙醇定容到10 mL，將其中8支比色管放在 1.34 mW/cm2 紫外光線強度的紫外燈下分別照射10、20、30、50、70、110、180 min后掃描其紫外可見吸收曲線。

1.2.5 溶劑對白藜蘆醇溶液的影響 分別稱取白藜蘆醇0.000 25 g，轉入25 mL比色管中，分別加入水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、己烷定容至25 mL，配制成濃度為10.0 μg/mL的溶液，用UV-Vis光譜儀進行光譜檢測。掃描時不同溶劑用不同的參比。

1.2.6 酸堿與白藜蘆醇溶液的反應 分別向2個比色管中移入0.2 mL的168 μg/mL白藜蘆醇儲備液，用無水乙醇定容至10 mL。向其中一支比色管中逐滴滴加0.01 mol/L的鹽酸，振蕩，逐次進行紫外可見光譜掃描。pH值從4.6降低到3。向另一支比色管中逐滴滴加0.01 mol/L的氫氧化鈉，振蕩，逐次進行紫外可見光譜掃描。pH值從4.6上升到9。

1.2.7 H2O2與白藜蘆醇溶液的反應 移取168 μg/mL白藜蘆醇儲備液0.2 mL于25 mL比色管中，用無水乙醇定容至10 mL，不斷滴加0.04 mol/L的過氧化氫溶液，反應5 min，用UV-Vis光譜儀進行光譜檢測。

1.2.8 白藜蘆醇與DPPH·的反應及清除率效應 移取 168 μg/mL 白藜蘆醇儲備液0.2 mL于25 mL比色管中，用無水乙醇定容至10 mL，不斷滴加0.176 μg/mL的DPPH· 乙醇溶液，暗處反應5 min，用UV-Vis光譜儀進行光譜檢測。

1.2.9 銅離子對白藜蘆醇的影響 移取168 μg/mL白藜蘆醇儲備液0.2 mL于25 mL比色管中，用無水乙醇定容至 10 mL，不斷滴加0.02 mol/L的硝酸銅溶液，反應5 min，用UV-Vis光譜儀進行光譜檢測。

2 結果與分析

2.1 不同濃度白藜蘆醇的紫外可見光譜

由圖1可知，白藜蘆醇在217 nm處有一吸收，在300～330 nm處存在強度更大的寬吸收峰。從a到f，隨著白藜蘆醇溶液濃度升高，白藜蘆醇的2處吸收峰位置不變且吸收強度逐漸增強，217 nm峰變銳，300～330 nm峰明顯分成2個肩峰，其中在306 nm左右又稍強些，所以通常把306 nm作為特征吸收來研究其含量的變化，只是測試濃度不能太小，否則306 nm峰太鈍。

2.2 不同溫度白藜蘆醇的紫外可見光譜

由圖2可知，隨著溫度的升高，白藜蘆醇溶液吸收曲線總體形狀沒有發生改變，306 nm特征吸收峰位置也沒有移動，全波段的吸收強度都隨溫度的升高有規律地減小，初步說明在持續受熱條件下，部分白藜蘆醇發生了分解，且溫度越高變化越顯著。同時，由圖3可知，80 ℃下放置一段時間后，白藜蘆醇溶液吸收曲線基本形狀沒有改變，特征吸收峰沒有變化，在0.5～5.5 h內，300～330 nm吸光度隨放置時間延長而遞減。這同文獻報道的結果[4-5]一致。

2.3 紫外線照射后的白藜蘆醇紫外可見光譜

由圖4可知，常溫下白藜蘆醇經一段時間一定強度紫外線照射后，其紫外可見吸收曲線基本形狀逐漸在改變。（1）300～330 nm吸收強度隨照射時間延長而降低，右邊的肩峰降低更大，30 min后2峰幾乎消失，而在287 nm處出現一鈍峰，或者說特征吸收峰減弱且藍移至287 nm處，在接下來的試驗時間內該吸收位置不再發生移動，可能生成了某種穩定的產物。（2）在白藜蘆醇217 nm處吸收峰逐漸增強，且也發生藍移。文獻[6-7]研究光照對白藜蘆醇的影響，發現白藜蘆醇在紫外光照下會發生順反異構。反式與順式白藜蘆醇在紫外光210 nm處有強吸收，其第二吸收峰分別在305～330 nm 和280～295 nm處。史先敏等用HPLC方法研究發現溫度對白藜蘆醇結構變化的影響要遠小于光照對白藜蘆醇結構的影響[4]，說明白藜蘆醇的熱穩定性要高于光穩定性。

比較圖2和圖4發現，圖4中顯示的白藜蘆醇光譜發生的變化遠大于圖2。

2.4 不同溶劑中的白藜蘆醇紫外可見光譜

白藜蘆醇在四氯化碳、三氯甲烷、己烷中不溶，在乙腈、乙酸乙酯中能溶，易溶于乙醇、甲醇和水中。白藜蘆醇的溶解度大小和溶劑的極性大小基本一致，溶解性隨溶劑極性的減小而降低。由圖5可知，白藜蘆醇的特征吸收峰位置不隨溶劑變化而改變，且在所選溶劑中，甲醇體系中吸收強度最大。

2.5 不同酸堿度下的白藜蘆醇紫外可見光譜

由圖6可知，白藜蘆醇溶液中加入不同量的鹽酸后，在pH值從4.6降低到3范圍內，其光譜圖形狀發生明顯變化。300～330 nm處吸收峰位置和形狀基本未發生變化，而吸收強度則隨鹽酸加入量的增多逐漸減弱。217 nm處吸收銳鋒吸收強度逐漸降低，以致消失，而235 nm處肩峰衰弱比較慢，以致成為該波段的主峰，但是隨著酸量增加，也趨于消失。

由圖7可知，向白藜蘆醇溶液中逐滴加入氫氧化鈉時，隨著白藜蘆醇體系中加入堿的量逐漸增大，pH值從4.6上升到9，白藜蘆醇的紫外可見吸收光譜圖發生明顯變化。在300～330 nm處的特征吸收峰隨著氫氧化鈉的加入越來越弱，306 nm 的左肩峰衰變更快，最終看不出明顯吸收峰；同時，在340 nm左右產生新峰，成為體系的特征吸收峰，該峰強度隨著堿量增加逐漸衰減。在217 nm處吸收峰迅速降低，在其右側出現1個紅移吸收峰，隨著氫氧化鈉量增加，峰逐漸紅移，同時吸收強度依次遞減。與酸性條件相比，堿性條件下，白藜蘆醇特征吸收峰紅移，可能是白藜蘆醇分子與堿反應生成白藜蘆醇負離子，增強了白藜蘆醇體系的共軛效果。

2.6 H2O2與白藜蘆醇溶液的反應光譜圖

由圖8可知，在白藜蘆醇溶液中，從b到h，隨著H2O2加入量的不斷增加，白藜蘆醇乙醇溶液在300～330 nm處的吸收峰逐漸降低，最后逐漸消失，說明白藜蘆醇的特征結構已經遭到破壞，而217 nm處的尖銳吸收峰位置幾乎不變只是強度逐漸增強。

2.7 白藜蘆醇清除DPPH·自由基的光譜圖

從圖9可以看出，在DPPH·乙醇溶液中滴加白藜蘆醇后，DPPH·的517 nm吸收峰位置沒有變化，只是吸收強度逐漸衰減；在DPPH·的326 nm處吸收峰位置也沒有明顯移動，可是吸收強度逐漸增強。說明白藜蘆醇能消除體系中的DPPH·自由基，具有抗氧化作用。范金波等通過比較發現，幾種天然多酚清除自由基的活性，其中白藜蘆醇>BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）>根皮素>根皮苷[8]。

2.8 白藜蘆醇與硝酸銅溶液的螯合反應

由圖10可知，在白藜蘆醇溶液中，隨著硝酸銅溶液加入量的不斷增加，白藜蘆醇乙醇溶液在300～330 nm處的吸收峰逐漸降低，而217 nm附近的尖銳吸收峰逐漸增強。

3 結論

本試驗采用紫外可見分光光度法定性研究了白藜蘆醇在不同體系中的穩定性，初步跟蹤了白藜蘆醇與H2O2、DPPH·的反應。發現白藜蘆醇的穩定性較差，溫度、紫外光照、持續受熱、酸堿條件、氧化劑和自由基等都會引起它的分解或轉化。光照對白藜蘆醇結構的破壞大于溫度因素。

參考文獻：

[1]付元慶，李 鐸. 白藜蘆醇[J]. 營養學報，2014，36（1）：13-16.

[2]曹 庸，于華忠. HPLC法測定虎杖白藜蘆醇的含量及其穩定性研究[J]. 林產化學與工業，2004，24（2）：61-64.

[3]鄭湘娟，余淑嫻，羅冬梅.白藜蘆醇在提取液中穩定性研究[J]. 食品科技，2009，34（10）：177-183.

[4]史先敏，嚴澤民，謝靜紅，等. 白藜蘆醇的光穩定性和熱穩定性研究[J]. 日用化學工業，2011，41（3）：204-207.

[5]葉秋雄，黃 葦. 白藜蘆醇苷的穩定性研究[J]. 食品工業科技，2011，32（4）：155-156.

[6]韓晶晶，劉 煒，畢玉平. 白藜蘆醇的研究進展[J]. 生物工程學報，2008，24（11）：1851-1859.

[7]張煜梅，黃健花，金青哲，等. 反式及順式白藜蘆醇光穩定性分析[J]. 食品與發酵工業，2013，39（11）：250-252.

[8]范金波，蔡茜彤，馮敘橋，等. 5種天然多酚類化合物抗氧化活性的比較[J]. 食品與發酵工業，2014，40（7）：77-83.