核糖體失活蛋白（α-MC）亞細胞定位及對TMV的抑制作用

魏周玲，彭浩然，潘琪，張永至，蒲運丹，吳根土，青玲，孫現超

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核糖體失活蛋白（-MC）亞細胞定位及對TMV的抑制作用

魏周玲，彭浩然，潘琪，張永至，蒲運丹，吳根土，青玲，孫現超

（西南大學植物保護學院，重慶 400716）

【目的】克隆獲得苦瓜、商陸，在煙草中異源表達觀察兩個蛋白在細胞中的定位情況。研究-MC對煙草花葉病毒（，TMV）的抑制作用及其引起的抗性防御反應?！痉椒ā扛鶕褕蟮赖纳剃懣共《镜鞍谆蛉蛄泻涂喙纤鼗蛉蛄?，設計并合成擴增和基因全長引物，通過RT-PCR及基因克隆方法，從苦瓜和商陸春葉克隆得到苦瓜、商陸；用WolfPSORT預測蛋白定位，將苦瓜-MC、商陸PAP分別融合在GFP和DsRed2的N端，構建融合蛋白表達載體，采用GFP和DsRed2標記進行亞細胞定位，驗證預測結果；通過農桿菌介導在本氏煙中瞬時表達-MC，再接種煙草花葉病毒，利用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分別檢測病毒在接種葉片的蛋白積累量和RNA表達量，分析瞬時表達-MC的抗病毒效果。利用qRT-PCR分析植物防衛相關基因的表達，探究其抗病毒機理。【結果】克隆得到基因和全長，分別為861和939 bp。Wolf PSORT預測顯示-MC和PAP主要定位于細胞質膜上。共聚焦熒光顯微鏡下觀察發現，分別用GFP和DsRed2標記的-MC和PAP均定位在本氏煙葉片表皮細胞質膜上，與Wolf PSORT預測的-MC和PAP定位結果相一致。異源表達的PAP對植物細胞毒性作用強，導致表達部位細胞壞死，異源表達-MC的植物細胞無明顯毒性，表達部位細胞完整。在本氏煙中異源表達-MC后，再接種TMV-GFP，在紫外燈下觀察發現-MC處理后的本氏煙在接種TMV-GFP 48 h后沒有出現綠色熒光，而對照組出現熒光。72 h后處理組出現零星熒光，但對照組的綠色熒光開始擴散，連續觀察，處理組幾乎沒有變化，接種TMV-GFP 6 d后，發現處理組的綠色熒光幾乎沒有擴大的趨勢，而對照組的綠色熒光已擴散至心葉；ELISA檢測表明，在接種TMV-GFP 6 d后的葉片中，對照組與健康植物的OD492比值幾乎已達到處理組的10倍以上；qRT-PCR檢測TMV RNA的含量，結果顯示對照組TMV RNA表達量是處理組的149倍左右，表明-MC對TMV復制和移動均有明顯抑制；qRT-PCR結果分析顯示，在只注射TMV、單獨表達-MC以及表達-MC后注射TMV的本氏煙中均被誘導表達，但后者的表達量是前兩個處理的約2.5倍左右，在只接種-MC和表達-MC后注射TMV的本氏煙中均檢測到，但后者的表達量顯著高出前者5—7倍，表明異源表達-MC可誘導植物中防衛相關基因的表達，從而引起更強的防御反應。【結論】異源表達-MC顯著抑制TMV，能夠激活植物防衛反應，且對植物細胞無明顯毒性。研究結果為利用異源表達-MC方法開發控制植物病毒新產品提供了參考依據。

核糖體失活蛋白；-MC；煙草花葉病毒；異源表達；亞細胞定位；防衛相關基因

0 引言

【研究意義】核糖體失活蛋白（ribosome- inactivating proteins，RIPs）是一類在植物中廣泛存在的毒蛋白，大部分核糖體失活蛋白都來自于高等植物，也有少部分的幾種來自于真菌、細菌以及藻類等[1]。RIPs作用于核糖體大亞基RNA的3′端莖環結構中一個高度保守的核苷酸區域sarcin/ricin結構域，破壞核糖體大亞基RNA的結構，使核糖體失活。RIPs發揮功能主要通過兩方面，一是RNA N-糖苷酶活性，具有脫嘌呤作用，從而抑制蛋白質合成[2]；二是RNA水解酶的活性，研究發現從巨曲霉（）中分離出來的-sarcin蛋白是一種RNase，幾乎可以水解所有生物來源的核糖體，導致核糖體失活[3]。近幾年的研究已經證實，植物基因編碼的RIPs在體外實驗以及轉基因植物中對病害都具有一定的抗性，包括廣譜性的抗病毒、抗真菌以及對昆蟲也有一定的抗性等[4-7]。因此，選擇核糖體失活蛋白苦瓜素-MC，研究異源表達-MC的抗病毒功能對于防治植物病毒病有重要的理論和實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，可以將核糖體失活蛋白分為3類[8]，第1類是I型RIPs，由分子量約為30 kD的單肽鏈蛋白組成；第2類是II型RIPs，由一個類似I型RIPs的酶活性A鏈和一個稍大的凝聚素B鏈組成[9]；第3類是III型RIPs，但此類并不常見，僅在玉米和大麥中發現[10]。商陸抗病毒蛋白PAP和苦瓜素-MC均是I型RIPs，分子量約為29 kD。目前認為PAP是一種廣譜性的抗病毒蛋白，可以抗多種植物病毒，如TMV、黃瓜花葉病毒（）、苜?；ㄈ~病毒（）、非洲木薯花葉病毒（）以及花椰菜花葉病毒（）等[11]。對動物病毒如巨細胞病毒（）、流感病毒（）、脊髓灰質炎病毒（）、皰疹病毒（）、人體免疫缺損病毒（）也有一定的抑制作用[12-13]。但早前就有研究證明，全長的PAP對植物細胞具有一定的毒性，將克隆的PAP導入煙草，轉基因煙草出現明顯的生理變化，表現為矮化，葉片斑點及不育[14]。-MC生物學活性包括rRNA N-糖苷酶活性、RNA水解酶活性、DNA水解酶活性、抗腫瘤活性以及抗病毒活性等[15-16]。植物被病原物入侵時，能夠通過植物抗性基因產物和病原菌無毒基因的互作識別病原菌，同時激活局部和系統抗性反應[17]。RIPs可能參與植物這一防御反應的過程，從而對植物病毒具有一定的抗性。例如，已報道的在轉基因植物中商路抗病毒蛋白能夠引起PR蛋白的表達[18]?！颈狙芯壳腥朦c】Zhu等[19]研究發現從苦瓜籽提純的-苦瓜素在濃度為0.5 mg·mL-1時對植物病毒具有明顯的抑制作用，對玉米、小麥上的病原真菌也有潛在的抗性，提純的苦瓜素可作為一種農作物保護藥物抵抗植物病害。但若將苦瓜素開發成農藥，僅從苦瓜籽中提取苦瓜素，明顯無法滿足生產需求，轉基因異源表達-MC可以提供豐富的-MC，而目前對于異源表達-MC對TMV的抗性效果和機制尚不明確，且-MC在植物中的細胞定位及其表達后對植物細胞的影響還不確定?！緮M解決的關鍵問題】在本氏煙中異源表達-MC、PAP，明確二者亞細胞定位情況，并觀察異源表達-MC是否與PAP一樣引起植物的細胞死亡；分析在本氏煙中異源表達的-MC是否具有抗病毒作用，并明確其抗病毒機理，為更好地開發利用核糖體失活蛋白控制植物病毒病提供參考依據。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在西南大學植物保護學院植物病毒研究室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 供試大腸桿菌DH5購自北京全式金生物技術有限公司；根癌土壤農桿菌株EHA105由筆者實驗室保存；植物表達載體pPZP- RCS1、中間載體pSAT6-DsRed2-N1由美國紐約州立大學石溪分校Vitaly教授贈送；植物表達載體pCV-mGFP-C1由浙江省農業科學院陳劍平研究員實驗室饋贈；煙草花葉病毒熒光標記載體TMV-GFP（pSPDK661）由清華大學劉玉樂教授實驗室饋贈；供試本氏煙，在溫室育苗盆中播種，培養至4—6葉期備用。

1.1.2 試劑與引物 植物總RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒、高保真TaqTMDNA聚合酶、T4DNA連接酶購自大連寶生物工程公司；T-載體試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；限制性內切酶購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR獲得目的基因 利用植物總RNA提取試劑盒，從美洲商陸葉片和苦瓜葉肉提取總RNA，根據已報道的商陸抗病毒蛋白基因全序列（登錄號X55383）和苦瓜素基因全序列（登錄號X57682.1），設計并合成擴增和基因全序列引物，引物序列如表1，使用反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，進行PCR反應：95℃預變性4 min，進入循環94℃ 30 s，58℃ 40 s，35個循環；72℃ 1.5 min，共35個循環，72℃延伸10 min，16℃結束反應，擴增產物經DNA純化回收試劑盒純化后連接T載體克隆，挑取陽性單菌落測序分析。

表1 RT-PCR擴增目標基因序列引物

1.2.2 植物表達載體構建 提取測序正確的陽性克隆質粒，質粒經限制性內切酶II、I和HI、I雙酶切后割膠回收基因組片段，將酶切后的片段插入經II和I雙酶切的pSAT6-DsRed2-N1載體中，酶切后的片段插入經H I、I雙酶切的pCV-mGFP-C1的載體中。轉化大腸桿菌DH5感受態細胞，挑取陽性單菌落進行PCR驗證并測序，試劑盒提取質粒得到pSAT6-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP重組質粒。測序成功的重組質粒pSAT6-PAP-DsRed2用單酶切酶I切下表達框，插入經I酶切并去磷酸化后的植物表達載體pPZP- RCS1上，克隆后PCR鑒定并提取質粒酶切鑒定是否構建成功，由此構建植物表達載體pPZP-PAP-DsRed2。

1.2.3 農桿菌轉化 從-80℃冰箱取出保存的EHA105菌株，劃線平板，挑選單菌落接種于無抗生素的YEP液體培養基中搖菌12—16 h，CaCl2法制備感受態細胞。參考劉兆明等[20]方法，將pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP以熱擊法轉化到根癌土壤桿菌EHA105感受態細胞中，將含有pPZP-PAP-DsRed2的農桿菌菌液均勻涂布于含有100 μg·mL-1壯觀霉素和50 μg·mL-1利福平的YEP固體培養基上，將含有pCV--MC-mGFP的農桿菌菌液涂布于含有卡那霉素和利福平的YEP固體培養基上，28℃培養48 h，觀察菌落生長情況。挑取陽性單菌落進行PCR鑒定。

1.2.4 PAP和-MC蛋白的定位觀察 參考Li等[21]方法，采用根癌土壤桿菌滲入法將含pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP的菌體用瞬時轉染液懸浮并將OD600調到1.0—1.2左右，用重懸液分別浸潤四葉期本氏煙，置于培養箱中培養，每個處理重復3次。浸潤48—72 h即可在Zeiss LSM780共聚焦熒光顯微鏡下觀察浸潤的組織熒光。

1.2.5-MC對TMV的抗性檢測 先用含有pCV-- MC-mGFP的重懸液浸潤本氏煙，進行預處理，48 h后再于原接種葉注射含有TMV-GFP的重懸液，以含GFP空表達載體的農桿菌重懸液預處理植物再接種TMV-GFP為陽性對照，空表達載體重懸液處理作為空白對照。注射TMV-GFP 48 h后，在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動情況，拍照記錄并收集接種葉片，連續觀察。利用間接ELISA法檢測病毒的含量，包被液研磨葉片，離心，取上清加入ELISA板包被，洗滌后依次加入一抗、二抗，分別在37℃孵育2 h，最后加入含有鄰苯二胺的底物緩沖液在37℃恒溫箱避光顯色，顯色結束用濃硫酸終止反應。底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析[22-23]。用酶標儀（BIO-Tek；USA）測定OD492，當OD492處理組與健康植株對照相對比值＞2時，待測樣品為陽性，且OD492大小與顏色深淺直接正相關從而進行定量分析。

1.2.6 RNA提取和實時熒光定量PCR 本氏煙中異源表達-MC再接種TMV-GFP，72 h后收集接種葉片，用植物總RNA提取試劑盒提取植物葉片總RNA，RNA濃度通過酶標儀（Biotek，USA）測定，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。用Prime ScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa，Japan）試劑盒提供的方法將總RNA反轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR使用QuantinovaTMSYBR Green PCR Kit（QIAGEN，GER）擴增，內參基因選用，實時熒光定量PCR所用引物列見表2，每個試驗進行3次生物學重復。

表2 實時熒光定量PCR引物序列檢測基因的表達

2 結果

2.1和目的基因的克隆

用設計的和特異引物，以美洲商陸葉子和苦瓜葉肉的總RNA反轉錄產物為模板進行PCR，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示均擴增出與目的基因大小一致的條帶?；厥漳康钠?，連接至pGEM-T載體，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆測序，序列分析顯示所得基因分別為和，為939 bp，為861 bp。將目的基因和載體分別用相應的內切酶酶切后連接，構建分別與DsRed2和GFP融合表達的植物表達重組載體。用載體通用引物測序，結果表明目的基因成功構建入植物表達載體分別命名為pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP。

2.2 PAP和-MC蛋白的亞細胞定位

2.2.1 PAP和-MC蛋白的亞細胞定位的預測 確定蛋白在細胞內的分布是揭示蛋白功能的重要環節，為了解PAP和-MC蛋白的亞細胞定位，利用Wolf PSORT對其進行預測，結果表明PAP和-MC均有68.5%的機率定位在細胞質膜上，還可能在內質網膜和內質網內腔有少量分布（表3）。

2.2.2 PAP和-MC蛋白的亞細胞定位的驗證 為驗

證核糖體失活蛋白PAP和-MC在細胞中的定位預測，將成功構建的pPZP-PAP-DsRed2和pCV--MC-mGFP用熱擊法導入農桿菌EHA105，利用農桿菌介導的瞬時表達方法使其在本氏煙葉片中表達，48—72 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結果顯示，融合PAP- DsRed2和-MC-GFP融合蛋白的熒光均于細胞膜上分布，PAP-DsRed2在細胞質中也有少量分布（圖1），說明核糖體失活蛋白PAP和-MC在細胞中主要定位在細胞膜上，與預測結果基本一致。在本氏煙中表達PAP 48 h后，蛋白表達部位葉片大部分壞死（圖2），在共聚焦顯微鏡下雖可以觀察到紅色熒光，但只有極少數細胞完整。72 h后，表達蛋白部位葉片全部壞死，共聚焦顯微鏡下看不到完整表皮細胞，說明全長PAP對植物細胞具有明顯毒性。在本氏煙葉片中表達-MC 48 h后，蛋白表達部位顏色與周邊出現差異，共聚焦顯微鏡下可以觀察到完整的葉片表皮細胞；72 h后，葉片蛋白表達部位顏色沒有進一步改變，仍然沒有細胞崩解，表明全長-MC對本氏煙葉片細胞沒有可見毒性（圖2）。因此，后續試驗中可以用異源表達-MC分析其對TMV的抑制作用。

圖1 PAP和α-MC在本氏煙中的亞細胞定位

圖2 瞬時表達PAP和α-MC 48 h本氏煙的癥狀

表3 PAP和α-MC蛋白的亞細胞定位預測

2.3 異源表達-MC蛋白在本氏煙中對TMV的抑制作用

為明確在本氏煙中異源表達-MC蛋白是否對TMV有抑制作用，先對本氏煙進行預處理，將-MC瞬時表達48 h后，再接種TMV-GFP，在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動情況。結果顯示，先注射-MC處理后的本氏煙在接種TMV-GFP 48 h后沒有任何熒光出現，而對照組出現綠色熒光。72 h后處理組開始出現零星熒光，而對照組的綠色熒光開始擴散，連續觀察，處理組幾乎沒有變化，在接種6 d后，處理組的零星熒光有略微的擴大，而對照組的綠色熒光已經擴散至心葉（圖3-A），表明異源表達-MC蛋白對TMV具有抑制作用。為確定處理組和對照組中病毒的含量，分別采集48、72、144 h后的接種葉用間接ELISA法進行檢測。結果顯示，注射TMV-GFP 48 h后，處理組與健康植物的OD492比值＜2，表明沒有檢測到病毒，而對照組的OD492比值已經達到5；72 h后，處理組才檢測到病毒，而對照組與健康植物的OD492比值幾乎是處理組的5倍左右；144 h后，對照組的OD492比值是處理組的10倍以上（圖3-B），空白對照健康植株的OD492比值均在1左右，說明-MC瞬時表達對TMV侵染有明顯的抑制作用。為進一步驗證-MC的表達是否影響了病毒RNA的積累，采集接種TMV-GFP 72 h后的接種葉提取RNA，利用qRT-PCR檢測。結果發現，對照組TMV-GFP表達量是處理組的149倍左右，達到顯著水平（＜0.05），空白對照健康植株中沒有檢測到TMV-GFP（圖3-C），說明-MC表達后會影響病毒RNA的積累。

2.4 防衛相關基因的表達

已有報道稱轉基因植物中商陸抗病毒蛋白PAP可以誘導PR蛋白的表達[18]，-MC也是I型核糖體失活蛋白。因此本試驗中，為評估異源表達的-MC與防衛相關基因之間的關系，選用3個基因，檢測接種TMV-GFP 72 h后的本氏煙中3個基因的表達量。收集接種葉，進行qRT-PCR反應，結果發現，在只注射TMV、單獨表達-MC以及表達-MC后注射TMV的本氏煙中都被誘導表達，但后者的表達量是前兩個處理的約2.5倍左右，達到顯著水平（＜0.05）（圖4）。在只接種-MC和表達-MC后注射TMV的本氏煙中檢測到，但后者的表達量顯著高出前者5—7倍，達到顯著水平（＜0.05）。與對照組相比，單獨注射TMV的植物中也檢測到兩個基因的表達量增加。

A：表達α-MC本氏煙中TMV的侵染移動情況Symptoms of TMV-GFP infected N. benthamiana expressed α-MC under the UV light；B：ELISA檢測不同處理本氏煙中TMV含量Analysis of the accumulation levels of TMV inN. benthamiana expressed α-MC by enzyme-linked immunosorbent assay；C：qRT-PCR檢測不同處理TMV RNA的表達量Analysis of the expression levels ofTMV-GFPRNA inN. benthamiana expressed α-MC by qRT-PCR

圖4 qRT-PCR檢測α-MC預處理的本氏煙植物中NPR1、PR1、PR2的表達量

3 討論

苦瓜核糖體失活蛋白包括苦瓜凝集素、map30、-苦瓜素、-苦瓜素、-苦瓜素等，其中-苦瓜素和-苦瓜素都從苦瓜籽中分離出來，具有相似的結構和生物學特性[24-25]。研究表明，-苦瓜素具有抗HIV、抗HSV的特性并對尖鐮孢和瓜果腐霉均有抗性[4]。在本試驗中，通過農桿菌介導法將-MC在本氏煙中異源表達，接種TMV-GFP后，在紫外燈下觀察TMV-GFP的移動情況，結果顯示，異源表達-MC能夠抑制TMV的復制，表明可以進一步利用基因工程異源表達-MC來滿足開發利用所需。

現有的研究認為苦瓜RIPs可能是通過3種機制來發揮抗病毒作用的。一是使受感染細胞自身的核糖體失活而阻止蛋白質合成引起細胞死亡，進而抑制病毒的繁殖；二是直接作用于病毒的DNA和RNA，使其喪失轉運和復制功能；三是抑制與病毒復制有關的逆轉錄酶和整合酶的活性[26]。在本氏煙葉片中瞬時表達-MC和PAP，發現PAP表現出強烈的細胞毒性，與前人所報道一致[14]。而-MC對本氏煙葉片細胞沒有毒性，因而-MC應該不是通過引起細胞死亡來抑制病毒繁殖。在共聚焦顯微鏡下發現-MC定位在細胞質膜，而TMV運動蛋白是內質網膜跨膜蛋白，可與病毒核酸結合形成膜-運動蛋白-病毒核酸復合體，在細胞壁附近介導病毒核酸通過細胞胞間連絲[27-29]，因此，-MC抗病毒機制可能與Vandenbussche等[30]觀點類似，其在細胞膜上作用于病毒的這一復合體中的病毒核酸，抑制病毒移動。還有報道認為RIP可能作用于受侵染植物細胞的核糖體，從而抑制病毒蛋白的合成[31]。筆者在ELISA和qRT-PCR檢測后發現-MC處理的植株病毒和病毒RNA含量都非常低，這說明異源表達-MC不但能夠抑制病毒TMV蛋白質合成，也抑制RNA的復制積累。

核糖體失活蛋白也被認為是一種具有誘導系統抗性的多功能蛋白[7]。系統獲得性抗性的特點是活性氧的迸發、水楊酸的積累以及病程相關基因例如和的表達等[32]。有研究表明，核糖體失活蛋白MAP30可通過調節病毒和腫瘤細胞的基因表達而發揮作用，上調與細胞程序化死亡直接相關的的表達，以干擾病毒對腫瘤細胞程序化死亡的抑制[33]。Zhu等[19]研究發現自苦瓜籽中提純的苦瓜素噴灑本氏煙，再接種植物病毒，也會誘導防衛相關基因的表達。本試驗中，在異源表達-MC的本氏煙接種葉片中檢測到、和的表達，且表達量遠遠大于對照組，說明異源表達-MC在抑制TMV的同時也激活了植物的系統性抗性，這一系統抗性是否也抗其他植物病原的侵染有待進一步研究。

4 結論

-MC和PAP一樣均定位于植物細胞質膜。本氏煙中異源瞬時表達-MC具有抑制TMV侵染移動的作用，同時也可誘導本氏煙產生系統抗性。

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（責任編輯 岳梅）

Subcellular localization of the ribosome-inactivating protein-MC and Its antiviral effect on TMV

WEI ZhouLing, PENG HaoRan, PAN Qi, ZHANG YongZhi, PU YunDan, WU GenTu, QING Ling, SUN XianChao

(College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The objective of this study is to obtainthe alpha-momorcharin () and pokeweed antiviral protein () by cloning, observe the cellular localization of which inby heterologous expression, and to evaluate the effects of-MC on inhibiting(TMV) and the resistance defense response of.【Method】Based on the published sequences of-and, primer pairs for cloningandwere designed. RT-PCR and gene cloning were used to obtain the target genesandfrom the leaves ofand, respectively. First, subcellular localization of theMCandPAP was predicted through Wolf PSORT, then the fusion protein vectors for verifying the subcellular localization were constructed by fusing the-MC and PAP to the N-terminal of the GFP and DsRed2, respectively. The-MC was transiently expressed in theleavesby agro-infiltration, and the-MC expressed leaves were inoculated with TMV-GFP. The accumulation of the virions and viral RNA were detected by indirect ELISA and real-time quantitative PCR (qRT-PCR). In order to understand the antiviral mechanism of the-MC, the expression of plant defense-related genes including non-expressor of pathogenesis-related genes(,,) were evaluated by qRT-PCR. 【Result】The length of genesandobtained by RT-PCR were 861 and 939 bp, respectively. The subcellular localization showed that the coding proteins of-MC and PAP were predicted by Wolf PSORT to distribute on the plasma membrane. Under the confocal laser scanning microscope, the fusion proteins-MC-GFP and PAP-DsRed2 also distributed on the plasma membrane of the leaf epidermis cell of, which is consistent with the predicted results. It was observed that the heterologously expressed PAP produced strong toxic effects on tobacco leaf cells, which led to necrosis of the cells, while the heterologously expressed-MCshowed no obvious toxic effect on tobacco leaf cells, which were kept intact. Additionally, following the heterologous expression of-MC in, TMV-GFP was inoculated. After 48 hours, there was no green fluorescence observed in the-MC expressed leaves under UV light, but the green fluorescence could be observed in the control group. After 72 hours, sporadic green fluorescence was observed in the treatment group and the fluorescence in the control group started to spread. After 6 days, the green fluorescence spread to the spear leaf of the control group, while no obvious change was found in that of the treatment group. ELISA assay results showed that after 6 days of TMV-GFP inoculation, the value of OD492in the control group was over 10 times more than the value of samples under treatment. qRT-PCR data showed that the expression level of TMV in control group was 149 times than that of the level in group after treatment. Those data indicate that-MC has a significant impact on both replication and movement of TMV. The expression levels of several defense-related genes inleaves expressing-MC with or without TMV were tested through qRT-PCR. Data showed thatwas induced in both cases while the expression level was 2.5 times in plant with TMV injection than the one without injection. As toand, the expression of these two genes was 5-7 times higher in plants with TMV injection. Combining all those data together, it was suggested that the resistance effect of heterologously expressed-MC on plant viruses could induce the expression of responsive defense-related genes including,and, resulting in much stronger plant defense response. 【Conclusion】The heterologously expressed-MC significantly inhibited TMV, activated the plant defense response, enhanced the defense response of, and produced few toxicity to the plant cells. Therefore, the results will provide a reference for the development of new products for the control of plant viruses based on heterologous expression of-MC.

ribosome-inactivating proteins;-momorcharin;(TMV); heterologous expression; subcellular localization; defense-related genes

2016-11-01；接受日期：2016-11-30

國家自然科學基金（31670148）、重慶市社會事業與民生保障創新專項（cstc2015shms-ztzx80012）、中央高校基本科研業務費專項資金（XDJK2016A009，2362015xk04）

魏周玲，E-mail：13618216564@163.com。 通信作者孫現超，E-mail：sunxianchao@163.com