轉地蜂群病原微生物及腸道共生菌的變化

劉珊，王劉豪，郭軍,2，李繼蓮，徐龍龍

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轉地蜂群病原微生物及腸道共生菌的變化

劉珊1，王劉豪1，郭軍1,2，李繼蓮1，徐龍龍1

（1中國農業科學院蜜蜂研究所農業部授粉昆蟲生物學重點實驗室，北京100093；2昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500）

【目的】探明轉地放蜂過程中常見蜜蜂病毒和寄生蟲的流行規律，及不同地區工蜂腸道中兩種主要共生菌和的變化情況?！痉椒ā?在轉地放蜂過程中，對同一意大利蜜蜂()蜂場的固定蜂群連續取樣，采用RT-PCR方法檢測蜂群中病毒和寄生蟲的感染情況，使用SPSS 17.0軟件對不同地區、不同季節樣本的病毒和寄生蟲感染率進行卡方檢驗。以蜜蜂為內參基因，對不同地區樣本中的共生菌和進行熒光定量PCR分析，檢測轉地過程中工蜂腸道中這兩種細菌的變化情況，并采用Kendall Rank相關系數對病原物感染率和共生菌含量進行相關性分析?！窘Y果】 轉地放蜂7個地區的樣本中，僅檢測出以色列急性麻痹病毒（IAPV）、黑蜂王臺病毒（BQCV）和蜜蜂殘翅病毒（DWV）3種蜜蜂病毒。其中IAPV和BQCV在所有地區均有檢出且感染率較高，不同地區之間感染率差異顯著；DWV感染率相對較低，不同地區之間感染率差異極顯著。西方蜜蜂微孢子蟲（）在各地區樣本中均未檢出，東方蜜蜂微孢子蟲（）在4個地區的樣本中檢出，且不同地區間感染率差異極顯著，熊蜂微孢子蟲（）在各個地區均有檢出，不同地區間感染率差異顯著；季節性差異分析表明，IAPV在不同季節的感染率差異不顯著，而BQCV、DWV、和在不同季節的感染率差異顯著，且春夏季的感染率普遍高于秋冬季；不同轉地地區的工蜂腸道內均含有共生菌和, 且兩種共生菌含量在不同地區間均差異極顯著；相關性分析表明，和IAPV之間呈顯著負相關作用。【結論】轉地蜂場工蜂病原微生物的檢測結果表明IAPV、BQCV、DWV和微孢子蟲在蜂群中普遍存在；蜜蜂病原物的感染率和腸道共生菌的含量在不同地理區域間差異顯著；部分病原物與腸道共生菌間呈顯著負相關關系；轉地放蜂方式對蜜蜂的健康狀況有一定影響。

轉地放蜂；意大利蜜蜂；病原微生物；共生菌；熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】蜜蜂轉地飼養是一種流動型的養蜂方式。中國地域遼闊，蜜粉源植物豐富，不同季節花期交錯，養蜂人員為了充分利用各地蜜粉源植物繁殖蜂群，擴大養蜂生產，增加蜂產品產量，每年都會進行轉地放蜂飼養[1]。中國是世界上最大的養蜂國之一，200萬群東方蜜蜂飼養量和600萬群的西方蜜蜂飼養量均居世界首位，為農業生產創造了巨大的經濟價值[2]。轉地養蜂是中國主要的養蜂方式之一，但有研究表明，轉地養蜂會影響蜜蜂的健康[3]，其中蜜蜂病毒和寄生蟲在轉地過程中的廣泛傳播是主要影響因素之一[3-4]。另一方面，蜜蜂腸道內有著數量眾多的共生菌群，它們在營養吸收、抵抗病原物侵染、增強機體免疫力等方面均發揮著積極作用[5-7]。因此，探究轉地養蜂過程中蜜蜂病原微生物與腸道共生菌群的變化，對于蜜蜂疾病的防控以及養蜂業的發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】蜜蜂病毒傳播廣泛，可以感染不同生長階段和不同級型的蜜蜂，且在蜂箱、蜂糧及蜜蜂寄生蟲體內都可檢測到[8-11]。但大多數病毒在蜜蜂表現癥狀之前都存在著隱形感染現象[12-13]，當受到特定的外界壓力如寄生蟲感染、周圍環境變化時，蜜蜂病毒被激活并快速增殖，表現出強致病性并導致宿主的快速死亡[14]。另一方面，9大類蜜蜂腸道微生物卻與蜂群的健康密切相關[15]，有研究表明它們和宿主相互協作從而增加整個機體的適應性[16]，其中-變形菌綱的和-變形菌綱的是蜜蜂腸道中的優勢菌，占成年工蜂回腸和中腸中菌群總數的50%以上，為中腸內的優勢菌群，為回腸中的優勢菌群[17]。此外有關中國不同地區蜜蜂病原物及共生菌的研究也有著許多報道，LI等[18]對中國19個省（市、地區）的中華蜜蜂（）病原物感染和共生菌的數量變化情況進行了詳細報道；AI等[19]對中國18個?。ㄊ小⒌貐^）的意大利蜜蜂（）蜂場常見7種蜜蜂病毒感染情況進行調查；YANG等[20]對中國7個?。ㄊ小⒌貐^）的意大利蜜蜂蜂場常見10 種病原體的感染率進行了系統研究；賈慧茹等[21]對北京地區6種蜜蜂病毒的感染情況進行普查等，但目前仍缺乏轉地蜜蜂飼養流行病學和共生菌方面的研究。【本研究切入點】近年來關于蜜蜂流行病學的研究大多是從各個省區采集大量蜜蜂樣品進行檢測。而對于轉地放蜂的過程中，同一蜂場內在不同季節及不同蜜源條件下，蜜蜂病原微生物流行規律和共生菌變化情況尚缺乏研究。【擬解決的關鍵問題】探明轉地放蜂過程中常見蜜蜂病毒和寄生蟲的流行規律，及不同地區工蜂腸道中兩種主要共生菌和的變化情況及與病原物的相關性，進一步探討轉地飼養方式對蜜蜂健康的影響，為蜜蜂疾病的防治措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2015年4—12月的轉地放蜂期間，對同一蜂場的指定蜂群進行取樣。試驗共選擇7個采集地區，采集的蜜源植物和地點分別為油菜（湖北省浠水縣）、洋槐（河北省靈壽縣）、椴樹（吉林省延邊縣）、蕎麥（內蒙古赤峰市）、芝麻（河南省新蔡縣）、鹽膚木（湖北省英山縣）和茶樹（湖北省浠水縣），每個地區均在固定的6群蜂中取樣，每群取5只工蜂檢測病毒和微孢子蟲。共采集工蜂樣本210只，且均為活蜂，采樣后裝入含有糖粉的小盒中運輸至實驗室，工蜂樣品取腸道提取DNA，檢測3種微孢子蟲和2種腸道內共生菌，剩下的部分提取RNA，檢測7種常見蜜蜂病毒。

1.2 DNA的提取及PCR檢測

剪取每只蜂的腹部并拉取腸道，分別放入不同離心管中，加入100 μL Krebs Ringer solution，使用無菌的研磨棒將腹部研磨成勻漿。每個樣品取50 μL勻漿，按照DNA提取試盒的操作方法（Wizard ? SV 96 Genomic DNA Purification System，Promega）提取DNA。提取后將DNA用于檢測東方蜜蜂微孢子蟲（）、西方蜜蜂微孢子蟲（）和熊蜂微孢子蟲（），引物如表1所示。PCR反應體系：500 ng模板DNA，12.5 μL Mix，10 mmol·L-1正反向引物各1 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應條件：94℃4 min，然后94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環，最后72℃ 10 min。每次PCR均做陰性（ddH2O）和陽性對照。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，染色后觀測結果。部分目的條帶使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（Takara，Japan）回收PCR產物，送至公司測序以驗證試驗結果。

表1 本試驗采用的PCR引物

1.3 RNA的提取及RT-PCR檢測

采用Trizol法提取拉取腸道后剩余部分蜜蜂樣本的總RNA，并對采集的所有樣品進行蜜蜂病毒RT-PCR檢測。選擇7種常見病毒蜜蜂急性麻痹病毒（ABPV）、黑蜂王臺病毒（BQCV）、蜜蜂慢性麻痹病毒（CBPV）、蜜蜂殘翅病毒（DWV）、克什米爾蜜蜂病毒（KBV）、蜜蜂以色列急性麻痹病毒（IAPV）和囊狀幼蟲病病毒（SBV）。將提取好的RNA取1 μg，利用反轉錄試劑盒（Takara，Japan）合成cDNA。將合成的cDNA進行PCR擴增反應，病毒引物參考文獻（表1）。PCR反應體系：Mix 12.5 μL，正向和反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補至25 μL。PCR條件：反轉錄48℃ 45 min，95℃ 2 min，然后95℃ 30 s，55℃ 1 min，68℃ 2 min，共40個循環，68℃ 7 min。每次RT-PCR均做陰性（ddH2O）和陽性對照。PCR產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，染色后在紫外燈下觀測結果。使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（TaKara，Japan）回收PCR產物，送至公司測序。

1.4 腸道細菌的熒光定量PCR檢測

將上述提取的DNA樣品進行分組，每個地區的樣品分為一組，每組取5只工蜂作為生物學重復進行檢測。使用SYBR Green染料進行實時熒光定量PCR，對不同地區工蜂樣本中的共生菌和的表達量進行測定。qPCR擴增使用Mx3005P real-time PCR系統（Stratagene，La Jolla，CA）。為確保擴增效率，使用蜜蜂為內參基因。、和的引物如表1所示。 qPCR反應條件：95℃3 min，然后95℃30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，40個循環，隨后進行熔解曲線分析：55—95℃，0.5℃/read 1 s hold。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。對陽性結果進行目的片段的回收并測序，測得的序列在NCBI上進行對比。不同表達水平的細菌基因和使用循環數的閾值（Ct值）來衡量。每個樣品作3個復孔以減少試驗誤差。目的基因表達水平用ΔΔCt法計算：目的基因的相對表達量=2-ΔΔCt，ΔΔCt= (Ct/target gene-Ct/actin) test group-(Ct/target gene-Ct/ actin)control，以表達量最低的樣品作為參照進行計算，柱狀圖結果均用“平均值±標準誤”表示。

1.5 統計分析

使用SPSS 17.0軟件進行數據分析。首先對檢測出病毒和寄生蟲的樣品，根據感染病原種類進行統計，算出每個地區每種蜜蜂病毒和寄生蟲的感染率；再通過卡方檢驗，比較每種病原物在不同地區間、不同季節間感染率的差異；采用Kendall Rank相關系數，分析每個地區樣本中IAPV、BQCV和DWV的感染率與腸道共生菌數量的相關性；采用ANOVA方差分析的方法對不同地區之間工蜂腸道菌表達量進行統計分析。

2 結果

2.1 轉地蜂群病毒感染情況

從轉地放蜂經過的7個地區共采集210只蜜蜂工蜂，檢測7種常見蜜蜂病毒，結果如表2所示。在工蜂樣本中僅檢測出IAPV、BQCV和DWV。IAPV在所有地區都有檢出，其中河南省新蔡縣感染率最高，達97%；在吉林省延邊州感染率最低，為60%；不同地區之間IAPV的感染率差異顯著（2=14.5，=0.02）。BQCV在所有地區也均有檢出，其中吉林省延邊州感染率最高，達到77%；河北省靈壽縣感染率最低，為10%；不同地區間BQCV的感染率差異極顯著（2=43.1,=0.0001）。DWV的感染率相對較低，在7個地區中有5個地區檢出，在吉林省延邊州和內蒙古區赤峰市的感染率最高，為30%，不同地區間DWV的感染率差異極顯著（2=24.541，=0.001）。

表2 意大利蜜蜂蜂群樣本的采集情況及病原微生物的感染率

IAPV：蜜蜂以色列急性麻痹病毒；BQCV：黑蜂王臺病毒；DWV：蜜蜂殘翅病毒；：東方蜜蜂微孢子蟲；：熊蜂微孢子蟲

A：湖北省浠水縣Xishui, Hubei；B：河北省靈壽縣Lingshou, Hebei；C：吉林省延邊州Yanbian, Jilin；D：內蒙古赤峰市Chifeng, Inner Mongolia；E：河南省新蔡縣Xincai, Henan；F：湖北省英山縣Yingshan, Hubei；G：湖北省浠水縣Xishui, Hubei。圖中數值為平均值±標準誤，柱形圖上不同字母表示基因表達差異顯著（P＜0.05）Each value represented mean±SE, and different letters above bars indicated significant differences (P＜0.05)

2.2 轉地蜂群寄生蟲感染情況

西方蜜蜂微孢子蟲在各樣本中均未檢出；東方蜜蜂微孢子蟲在4個地區存在感染情況，感染率為23%—57%，湖北省浠水縣感染率最高，吉林省延邊州感染率最低，不同地區間感染率差異極顯著（2=54.115，=0.0001）；熊蜂微孢子蟲在各個地區均有檢出，其中湖北省浠水縣感染率最高，為70%；吉林和內蒙感染率最低，為27%?？ǚ綑z驗分析表明不同地區間熊蜂微孢子蟲感染率差異顯著（2=16.44，=0.012）（表2）。

2.3 轉地蜂群病原微生物季節性變化

將取樣時間按季節進行分類，4—5月為春季，7—8月為夏季，9—10月為秋季，12月為冬季。對每個季節取的樣品中病原物的感染率進行卡方檢驗，結果表明蜜蜂病毒IAPV在不同季節的感染率差異不顯著（2=2.236，=0.525），而BQCV、DWV在不同季節間的感染率差異極顯著（χ2=20.681，P=0.0001；χ2=21.176，P=0.0001）。在寄生蟲方面，熊蜂微孢子蟲和東方蜜蜂微孢子蟲在不同季節的感染率差異極顯著（χ2=12.597，P=0.006；χ2=62.286，P=0.0001）。

2.4 轉地蜂群腸道內共生菌的檢測與相關性分析

對不同地區蜂群的腸道菌和進行檢測和表達量測定，結果如圖1所示。在7個地區工蜂腸道中均含有共生菌和。方差分析結果表明，的含量在湖北省英山縣最多，在內蒙古區赤峰市最少，不同地區間數量差異極顯著（=0.0001）。的含量在湖北省英山縣最多，在河南省新蔡縣最少，且不同地區間數量差異也為極顯著（=0.004）。從兩種共生菌的含量來看，湖北省英山縣兩種共生菌的含量均最多，而河南省新蔡縣與內蒙古區赤峰市兩種共生菌的含量均較少，統計學分析表明工蜂體內兩種共生菌的總數在不同地區間存在極顯著差異（=0.0001）。此外，對不同地區樣本的病原物感染率和共生菌含量進行相關性分析，結果顯示共生菌的含量和IAPV的感染率呈極顯著負相關關系（Kendall’s tau rank：=0.878，=0.006）。

3 討論

本試驗研究了在轉地放蜂過程中不同地域和不同蜜源植物條件下，同一意蜂蜂場主要病原物的感染率和部分腸道共生菌的變化情況，結果表明不同病毒和寄生蟲的感染率在不同地區差異顯著，這可能是季節、蜜源植物、溫濕度和地理位置綜合作用的結果。在7種常見蜜蜂病毒中，僅檢測出IAPV、BQCV和DWV這3種病毒，其中IAPV的檢出率較高，為60%—97%，Cox-Foster等[33]研究表明，IAPV與蜜蜂崩潰綜合癥（CCD）之間有著強烈的相關性，所以推測CCD的主要病原可能為IAPV，李志國[34]研究顯示蜜蜂球囊菌（）是IAPV的載體，而本研究蜂群中IAPV的感染率較高，進一步說明了IAPV是危害蜜蜂的主要病毒之一。此外BQCV的檢出率也較高，該病毒通常在蜂群中不表現出癥狀，以一種隱形感染的方式長期存在于蜜蜂體內，Ribière等[35]研究表明BQCV與微孢子蟲共感染表現出強烈的致病性，本研究中同樣檢出了微孢子蟲的存在，因此控制蜂群蜜蜂微孢子蟲是減少BQCV感染的主要方式[36]。Shen等[37]研究表明大蜂螨（）是DWV傳播的載體，在本研究中DWV的感染率較低，這可能是由于轉地養蜂是在大流蜜期，而這個時期也是大蜂螨低流行期[18]；DWV夏季的感染率高于春秋季，可能是因為夏季溫度較高，濕度較大的環境更有利于DWV的傳播。另外本研究中的轉地蜜蜂從河北省浠水縣出發，經過5個地區后又回到浠水縣，而結果表明在此地區的兩個不同時間段內，3種病毒的感染率均較高，這說明地理位置和季節均對病毒感染率有著較大的影響。

蜜蜂微孢子蟲病是危害西方蜜蜂的主要病原物[38]，其中東方蜜蜂微孢子蟲被認為是對蜜蜂危害最為嚴重的一種病原[39]。本試驗在意蜂樣品中檢出大量東方蜜蜂微孢子蟲，卻沒有檢測到西方蜜蜂微孢子蟲，這與LI等[18]的研究結果一致，前期研究表明東方蜜蜂微孢子蟲最初感染東方蜜蜂，目前已取代西方蜜蜂微孢子蟲，在全世界傳播[39]，本研究也進一步證實了這一結論。東方蜜蜂微孢子蟲在春季的感染率顯著高于秋冬季，在本研究的秋冬季樣本中，沒有檢測到東方蜜蜂微孢子蟲的存在，這一結果為東方蜜蜂微孢子蟲不耐低溫，其傳播能力和毒力在寒冷環境下較低的結論提供了更有力的證據[18]。此外，本研究也在意蜂腸道內檢測到了熊蜂微孢子蟲，McIvor等[40]也有過類似報道，這一現象更進一步說明熊蜂微孢子蟲可進行跨種侵染。

和是蜜蜂體內普遍存在的優勢共生菌，從本研究中兩種共生菌的總數來看，在湖北省英山縣兩種共生菌的數量均最多，且與其他地區差異顯著，這可能是因為在湖北地區的蜜源植物鹽膚木與其他地區相比，蜜、粉更為豐富，為蜂群提供了充足的營養條件。此外，本研究還發現共生菌的含量與IAPV的感染率呈顯著負相關，LI等[18]發現感染東方蜜蜂微孢子蟲的中華蜜蜂體內共生菌數量較正常蜂顯著減少，這表明蜜蜂腸道菌群的組成可能影響其對病原物的敏感性，共生菌屏蔽病原的作用可能是蜜蜂對抗疾病的一種重要途徑[41]。Koch等[42]的研究結果也表明這兩種菌具有抵抗短膜蟲的作用，但這兩種菌是否具有抵抗病毒的作用還有待進一步研究。

中國是世界第一養蜂大國，轉地放蜂是一種特色的蜜蜂飼養形式，可在最大程度上充分利用蜜源植物，產生更高的收益[43]。而轉地放蜂主要采用卡車運輸，蜂群在運輸過程中處于受熱、缺水和振動的環境，且蜂群擺放相對集中，密度較大，破壞了蜜蜂的正常生活狀態，因此轉地放蜂很可能是蜜蜂疾病發生和傳播的因素之一。蜜蜂疾病的流行與暴發會給養蜂業造成巨大的經濟損失，因此對轉地蜂群蜜蜂疾病進行調查是非常有必要的。本研究通過對同一蜂場不同時期的病原微生物流行情況的調查，進一步明確了不同時期的病毒感染情況，以及共生菌和病原物之間的相關性。此外，多種因素如氣候、季節、地域和蜜源植物的不同，都可以對蜂群健康產生影響。但對于蜜蜂腸道共生菌的功能和有害病原物的致病機制，以及蜜蜂是否可以通過調控腸道菌群來控制病原物感染等問題仍需要進行更深入的研究。

4 結論

轉地飼養的意蜂蜂場中，IAPV、BQCV、DWV和東方蜜蜂微孢子蟲、熊蜂微孢子蟲均普遍存在感染現象，蜜蜂病原物的感染率和腸道共生菌的含量在不同放蜂區域之間差異顯著，且部分蜜蜂病原物與蜜蜂腸道共生菌間呈顯著負相關關系。轉地放蜂飼養行為對蜜蜂的健康狀況有一定影響。

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（責任編輯 岳梅）

The variation of Pathogens, Parasites and symbionts in Migratory honeybees ()

LIU Shan1, WANG LiuHao1, GUO Jun1,2, LI JiLian1, XU LongLong1

(1Key Laboratory of Pollinating Insect Biology of the Ministry of Agriculture, Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093;2College of Life Science, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500)

【Objective】The objectives of this study are to examine the occurrence and prevalence of viruses and parasites in migratory honeybees,, and to analyze the variation of two main symbiotic bacteriaand【Method】The virus and parasite infections were detected by RT-PCR in the same colony ofat different migratory locations. Theinfection rate of virus and parasite in different regions and seasons were analyzed by chi-square test. The honey bee-actin gene was selected as the reference gene, the quantitative real-time PCR (qPCR) was used to explore the quantity variation of symbiotic bacteriaandin the different regions, and the Kendall Rank correlation coefficient was used to analyze the correlation between the rate of pathogen infection and the quantity of symbiotic bacteria.【Result】In the seven regions, three viruses were found:(IAPV),(BQCV), and(DWV). The infection rates of IAPV and BQCV were higher in all regions, and the difference was significant among different regions. DWV infection rate was relatively low, and the infection rate among different regions was extremely significant.was not detected in all the samples.was detected in four regions and the infection rate was extremely significant among different regions.was detected in all regions and the infection rate among different regions was significant. The results showed that the infection rates of IAPVwas not significantly different in different seasons, but the DWV, BQCV,andinfection rates had significant differences in different seasons, and the infection rate in spring and summer was significantly higher than that in autumn and winter. The qPCR result showed that.and.were detected in all migratory beekeeping periods, and the difference of the two symbiotic bacteria in different regions was extremely significant. There was a significant negative correlation between the prevalence ofand IAPV. 【Conclusion】The results showed that IAPV, BQCV, DWV and microsporidia are prevalent in the migratory colonies. The infection rate of bee pathogens and the quantity of symbiotic bacteria are significantly different among different geographical areas; there are negative correlations between the incidence of some pathogens and the quantity of some symbiotic bacteria; migratory beekeeping has negative impacts on worker longevity and colony health.

migratory beekeeping;; pathogens; symbiotic bacteria; quantitative PCR

2016-10-19；接受日期：2016-11-28

國家自然科學基金（31572338）、中國農業科學院科技創新工程項目（CAAS-ASTIP-2016-IAR）、國家蜂產業技術體系建設專項（CARS-45）、農業部“948”項目（2015-Z9）

劉珊，E-mail：molige63@163.com。 通信作者李繼蓮，E-mail：bumblebeelil@hotmail.com