葡萄酒中植物乳桿菌蘋果酸-乳酸發酵潛能評價

卜瀟，薛雪，程靜，劉樹文,4,5

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葡萄酒中植物乳桿菌蘋果酸-乳酸發酵潛能評價

卜瀟1，薛雪2，程靜3，劉樹文2,4,5

（1西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；3中國農業大學食品科學與營養工程學院/葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；4陜西省葡萄與葡萄酒工程技術中心，陜西楊凌 712100；5西北農林科技大學合陽葡萄試驗示范站，陜西渭南 715300）

【目的】研究植物乳桿菌（）對赤霞珠葡萄酒進行蘋果酸-乳酸發酵（Malolactic Fermentation，MLF）的過程，評價植物乳桿菌的蘋果酸-乳酸發酵潛能，旨在開發潛在的葡萄酒植物乳桿菌商業蘋果酸-乳酸發酵啟動劑。【方法】以從新疆本土葡萄酒中篩選得到的糖苷酶活性較高的4株植物乳桿菌CS-1、XJ-14、XJ-25和XJA-2為研究對象，對未經過MLF的赤霞珠干紅葡萄酒分別進行MLF，試驗設置對照組（未進行MLF）。比較4株植物乳桿菌在葡萄酒MLF過程中菌株的生長情況、蘋果酸含量的變化及MLF前后葡萄酒香氣成分的差異，全面評價植物乳桿菌的蘋果酸-乳酸發酵潛能。【結果】4株植物乳桿菌在葡萄酒MLF過程進行前6 d，菌密度均有較大幅度的下降，而接種6 d后，菌密度的下降趨勢開始放緩；所有菌株均表現出良好的降酸能力，XJA-2的降酸能力略高于其余菌株，15d內能夠將葡萄酒中蘋果酸濃度由2.3 g·L-1降至1.0 g·L-1左右，但所有菌株均未能完成MLF；菌株XJ-25處理組能夠顯著降低原酒中的生青味等不愉悅的香氣并帶來更加濃郁的花香及果香，XJ-14處理組同樣能夠降低葡萄酒的生青味，但花香果香相對XJ-25較弱，而菌株CS-1處理組和菌株XJA-2處理組均略微降低了原酒中的生青味，但由于化學味和植物味水平的提升，掩蓋了原酒本身的花香和果香。【結論】利用植物乳桿菌XJ-25啟動MLF有利于乙醇酯類香氣物質的釋放，增強了葡萄酒的果香及花香特征，相對于其余3株植物乳桿菌菌株更有利于提高葡萄酒香氣質量。因此，植物乳桿菌XJ-25具有開發為商業發酵劑的潛能。

植物乳桿菌；蘋果酸-乳酸發酵；葡萄酒；降酸；香氣

0 引言

【研究意義】紅葡萄酒釀造過程主要包括由酵母菌完成的酒精發酵（alcoholic fermentation，AF）和由乳酸菌完成的蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）兩大部分[1-2]。乳酸菌可以利用葡萄酒中的蘋果酸將其轉化為乳酸，使酸度降低[3]，還可以通過糖苷酶水解糖苷類物質及其自身的代謝活動釋放揮發性香氣，從而改善葡萄酒的風味，提高葡萄酒的質量[4-9]。目前國內外尚無應用于葡萄酒發酵的商業植物乳桿菌蘋果酸-乳酸發酵劑，本試驗比較了4株由新疆葡萄酒中篩選出的植物乳桿菌在葡萄酒蘋乳發酵過程中的生長情況、降酸能力及其對葡萄酒香氣組分的影響，研究的開展對新型蘋乳啟動劑的開發具有重要意義。【前人研究進展】關于乳酸菌在葡萄酒MLF中的應用研究多集中于酒酒球菌（）[10-12]，但有學者發現植物乳桿菌（）同樣具有潛在啟動MLF的能力。LERM等[13]對從南非葡萄酒中分離出的23株和19株進行MLF，其中14.1、56、107和S5、S6、E53都成功完成了對Pinotage葡萄酒的蘋果酸-乳酸發酵。BRAVO等[14]從Patagonian紅葡萄酒中分離出53株，8株菌對酒精的耐受性較強，其中UNQLp 97和UNQLp 133具有較強的降酸能力，能夠很好的完成MLF。并且作為蘋果酸-乳酸發酵菌株，具有不同于的兩大優勢，一是含有與同源性不相同的蘋果酸-乳酸酶編碼基因，且比含有更多的酶編碼基因，如對葡萄酒增香起重要作用的糖苷酶、蛋白酶、酯酶、酚酸脫羧酶等；二是產細菌素，植物乳桿菌素可以防止乳酸菌的腐敗[15]。【本研究切入點】目前，國內外已有利用對葡萄酒或果酒進行降酸的報道，但其對葡萄酒香氣的影響卻鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】以從新疆赤霞珠葡萄酒中篩選出的4株CS-1、XJ-14、XJ-25和XJA-2為研究對象，對未經MLF的新疆瑪納斯地區赤霞珠干紅分別進行MLF，通過測定接種后菌株生長情況、蘋果酸含量及MLF前后的香氣成分的變化，全面衡量其MLF能力，旨在為植物乳桿菌成為新一代啟動葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵的發酵劑提供數據支持。

1 材料與方法

試驗于2015年在西北農林科技大學葡萄酒學院進行。

1.1 供試菌株及酒樣

植物乳桿菌菌株CS-1、XJ-14、XJ-25和XJA-2由實驗室從新疆赤霞珠葡萄酒中篩選得到，并保藏于西北農林科技大學葡萄酒學院微生物實驗室[16]。將-80℃條件下保存的菌株活化至第二代，然后以5%接種量將其接種至MRS培養基中，37℃培養至對數末期備用。

MRS培養基：葡萄糖20 g，酵母浸粉4 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，胰蛋白胨15 g，醋酸鈉5 g，牛肉膏5 g，檸檬酸銨2 g，吐溫-80 1 mL，加水至l L，調節pH至4.8左右，121℃滅菌20 min。

適應性培養基：無菌水﹕無菌葡萄酒=1﹕1，葡萄糖2%，酵母浸粉0.4%[17]。

試驗酒樣，選用新疆瑪納斯地區酒精發酵結束、未啟動蘋果酸-乳酸發酵的赤霞珠干紅葡萄酒（理化指標見表1）。

表1 酒樣基本理化指標

1.2 儀器與試劑

氣相色譜-質譜聯用儀GCMS-QP2010，紫外分光光度計UV-2450，日本島津公司；雷磁pH計（PHS-3C），上海儀電科學儀器股份有限公司；DH-420型電熱恒溫培養箱，北京科偉永興儀器有限公司。

蘋果酸試劑盒購于愛爾蘭Megazyme公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果酸-乳酸發酵試驗 將4株來源于葡萄酒中的植物乳桿菌（CS-1、XJ-14、XJ-25、XJA-2）分別在MRS培養基中培養至對數末期，以5%（v/v）的接種量接種于適應性培養基中，30℃下培養24 h，離心（5 000×，4℃，10 min），用無菌水調整細胞濃度為1.2×107CFU·mL-1，將4 L赤霞珠葡萄酒酒樣分裝在4個1 L的玻璃瓶中，以5%（v/v）接種量分別接種于1 L葡萄酒中，未經MLF（加入60 mg·L-1SO2且不添加菌體）的相同葡萄酒作為對照組，均做2個重復。滿瓶密封放置于20℃恒溫培養箱中，每3 d取樣，用平板計數法測定葡萄酒中各菌株菌落總數，用蘋果酸試劑盒（Megazyme）檢測蘋果酸含量，蘋果酸含量趨于穩定后用GC-MS測定各酒樣的香氣成分。

1.3.2 香氣物質的提取 采用頂空固相微萃取結合氣質聯用儀（HS-SPME-GC-MS）對香氣物質進行提取分析。將50/30 μm DVB/CAR/PDMS（Supelco，Bellefonte，PA）萃取頭在270℃條件下老化1 h。取5 mL酒樣加入到15 mL的樣品瓶中，再分別向瓶中加入氯化鈉1 g和2-辛醇內標液50 μL（0.234 g·L-1），并蓋好瓶蓋。40℃平衡30 min后將萃取頭插入樣品瓶，40℃恒溫萃取30 min后將萃取頭在GC-MS進樣口250℃解吸8 min，不分流進樣。

1.3.3 香氣成分GC-MS分析 GC條件：色譜柱為HP-INNOWAX Polyethyene Glycol（60 m×0.25 mm×0.25 μm（J&W scientific，USA）），以氦氣（He）為載氣，流速設為1 mL·min-1。柱溫升溫程序：80℃條件下保持1 min，然后升至220℃（速度為25℃·min-1），再升至250℃（速度為5℃·min-1），此溫度下保持20 min；進樣口溫度為250℃，進樣口壓力為13.56 psi，吹掃流量為55.9 mL·min-1，吹掃時間為0.75 min，質譜接口溫度為280℃[18]。

MS條件：掃描范圍為20—350 m/z，以EI+為電離源，離子源溫度為230℃，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.2 mA，檢測器電壓350 V[18]。

1.4 數據處理及分析

各菌株菌落總數及蘋果酸含量變化用Excel 2010軟件分析。

香氣物質數據分析采用NIST02圖譜庫檢索對檢出的物質進行定性和內標法半定量分析。數據結果用SPSS23.0進行主成分分析，差異顯著性分析采用Ducan檢驗，＜0.05。

2 結果

2.1 葡萄酒中菌落總數

如圖1所示，將4株菌分別經過適應性培養基培養后接入葡萄酒中，菌落總數均呈持續下降的狀態，且下降幅度基本保持一致。從接種后到第6天，菌密度有較大幅度的下降，而接種6 d后，菌密度的下降趨勢開始放緩。接種至第9天時，菌落總數仍保持在106CFU·mL-1。

2.2 葡萄酒中L-蘋果酸含量

如圖2所示，4株植物乳桿菌接入酒樣后L-蘋果酸濃度的變化可以看出，接入植物乳桿菌的葡萄酒中L-蘋果酸濃度都有所下降。接菌15 d后，活菌數已經降到很低的水平，此時酒樣中的L-蘋果酸濃度仍保持在1.0 g·L-1左右，4株菌均不能對蘋果酸進行完全降解，說明發酵未完成，但4株菌均表現出了良好的降酸能力。菌株XJA-2處理組能夠將2.3 g·L-1的L-蘋果酸在15 d內降至1.0 g·L-1，降酸效率略高于菌株XJ-14處理組和菌株XJ-25處理組，菌株CS-1處理組的降酸效率相對較低。

2.3 葡萄酒中香氣成分

為分析4株植物乳桿菌進行MLF對葡萄酒香氣的影響，將5種不同處理的酒樣經GC-MS分析，香氣分析結果詳見表2。

表2 葡萄酒香氣成分的GC-MS分析結果

不同小寫字母表示同一行中相同發酵階段香氣化合物含量差異（＜0.05）

Differences of concentrations of aroma compound at the same fermentation period in the same row were (＜0.05) and were labeled by different small letters

如表2所示，酒樣中共檢出香氣化合物54種，其中酯類21種，醇類17種，脂肪酸類6種，萜烯類6種，其他化合物4種。這些物質在各組中均檢出，各組總香氣含量在發酵過程中均表現出一定的差異：未進行MLF的對照組中香氣物質總含量為855.55 mg·L-1；用菌株CS-1、XJ-14、XJ-25和XJA-2進行MLF后，香氣物質總含量分別為1 057.53 mg·L-1、1 376.71 mg·L-1、1 609.65 mg·L-1和1 006.38 mg·L-1。說明植物乳桿菌對葡萄酒的MLF過程對香氣種類的影響較小，而對其含量影響顯著。將香氣分析結果按酯類、醇類、脂肪酸類、萜烯類和其他化合物進行統計，由于不同類別含量差距較大，因此分析結果用不同的單位來表示（表2）。經過4株植物乳桿菌MLF的酒樣中酯類物質含量均顯著高于未經過MLF的酒樣，其中乙醇酯類物質含量有較大幅度的提升，主要包括乙酸乙酯和乳酸乙酯，其中菌株XJ-25處理組顯著高于其余處理組。醇類物質的含量在MLF后均有增加，其中2,3-丁二醇的濃度顯著增加，而一些醇類物質如異戊醇、己醇等，經過MLF后含量降低。萜烯類物質含量在MLF后均有所降低。

2.4 特征香氣的主成分分析

超過閾值的香氣化合物會對葡萄酒的特征香氣產生較大影響[19]，將檢出的香氣化合物中超過閾值的香氣物質進行描述并分類（表3）。為了評價各香氣化合物對總香氣的貢獻，通過香氣濃度除以香氣閾值（OT）來計算各香氣化合物的香氣值（OAV），香氣閾值根據以往文獻獲得[19-26]。OAV值大于1的說明其香氣活動能夠被人所感知，小于1則不能被人感知。從理論上來說，香氣值小于1的化合物被認為對整體香氣沒有直接貢獻。

為了進一步挖掘香氣數據中的差異，對超過閾值的香氣數據進行主成分分析（圖3），共提取兩個主成分。兩個主成分占總體方差的76.82%，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別解釋總方差的52.04%和24.78%。XJ-25和XJ-14處于PC1的正向端；對照組處于PC1負向端，PC2的正向端；CS-1處于PC1負向端；XJA-2處于PC1和PC2的負向端。XJ-25的PC1正向載荷高，PC2的正向載荷低，而β-紫羅蘭酮、辛酸異戊酯、乙酸乙酯、2,3-丁二醇、異丁醇等具有較高的PC1正向載荷，因此，XJ-25處理組具有果香和清新花香的香氣特征（表3）。XJ-14在PC1和PC2的正向載荷均較弱，因此較低含量的β-紫羅蘭酮、辛酸異戊酯、2,3-丁二醇、苯乙醛及較低含量的己醇、癸酸乙酯反應了XJ-14處理組的香氣特點，以花香和果香為主，生青味相對較弱（表3）。對照組在PC1和PC2的負向載荷均較強，較高含量的己醇、癸酸乙酯和異戊醇可以反應其香氣特點，表現出生青味及果香（表3）。CS-1在PC1負向端的載荷，較低含量的異戊醇、辛酸乙酯及己酸乙酯能夠反應其香氣特點，因此CS-1處理組表現出果香，化學味及酒精味（表3）。而XJA-2的PC1負向載荷低，PC2負向載荷高，表現出一定的奶酪或化學味（表3）。綜上所述，XJ-25處理組能夠顯著降低葡萄酒中的生青味，并帶來較為濃郁的花香和果香；XJ-14處理組同樣能夠降低葡萄酒的生青味，但花香、果香相對XJ-25較弱；CS-1處理組及XJA-2處理組使葡萄酒的花香和水果香氣變弱，化學味及植物味變得相對突出。

表3 香氣值、香氣描述及香氣系列

3 討論

3.1 葡萄酒中菌落總數的變化

4株菌接入葡萄酒中后，菌落總數均呈持續下降的狀態，且下降幅度基本保持一致。LERM等[13]將植物乳桿菌以107CFU·mL-1接入Pinotage葡萄酒中后，2 d后菌密度有所下降，但仍在107CFU·mL-1，接菌后第6天菌落數下降至106CFU·mL-1。試驗結果與何志剛等[31]將植物乳桿菌R23接入枇杷酒中進行MLF時測得的菌落總數持續下降的趨勢也較一致，這主要是由于葡萄酒中苛刻的環境導致植物乳桿菌的生長速率低于死亡速率，從而導致活菌的數量下降。

3.2 葡萄酒中L-蘋果酸含量的變化

在接菌3 d內，L-蘋果酸濃度呈現小幅度的下降趨勢，而6—9 d內，L-蘋果酸濃度大幅下降，其原因可能是由于死亡菌體的大量裂解釋放出了胞內的蘋果酸-乳酸酶，將葡萄酒中的L-蘋果酸轉化為乳酸[31]。15 d后L-蘋果酸濃度已趨于平穩但仍有下降的趨勢，說明殘余的植物乳桿菌使細胞裂解釋放出的蘋果酸-乳酸酶仍能進一步作用于葡萄酒中的L-蘋果酸，導致酒中L-蘋果酸濃度緩慢降低[17]。菌株XJA-2處理組降酸效率略高于菌株XJ-14處理組和菌株XJ-25處理組，菌株CS-1處理組的降酸效率相對較低，這與李靜等[32]用植物乳桿菌對獼猴桃酒進行降酸處理的結果一致。

3.3 葡萄酒中香氣成分的差異

酯類通常具有類似蘋果、香蕉或菠蘿等果香，是對葡萄酒香氣質量貢獻較大的一類香氣物質[33]。經過MLF，4株植物乳桿菌對葡萄酒中乙醇酯類物質含量均有顯著提升，其中菌株XJ-25處理組顯著高于其余處理組。周安玲等[34]在做乳酸菌對干紅葡萄酒揮發性成分影響的試驗中也發現，來源于泡菜中的植物乳桿菌C5由于其酯酶活性較高，從而促進了酯類物質的形成。

醇類是葡萄酒中含量最大的香氣物質，葡萄酒中的高級醇主要是由氨基酸或己糖通過丙酮酸途徑產生的，不同乳酸菌菌株代謝過程及酶活之間的差異，導致其代謝產物不同[34]。C6醇通常含有植物類的香氣，對葡萄酒香氣沒有積極的貢獻[35]，4個處理組中己醇的濃度均低于對照，苯乙醇和2,3-丁二醇具有非常濃的花香和果香氣味且閾值相對較低[23,26]。4個處理組中，菌株XJ-25處理組的苯乙醇及2,3-丁二醇含量顯著增加，這與周安玲等[34]的研究結果一致。而一些醇類物質如異戊醇、己醇等，經過MLF后含量降低，從而降低了酒中的化學味和生青味[25]。

脂肪酸類物質如己酸、異丁酸等具有腐敗味、酸苦味和脂肪氣味[21,23]，通常會對葡萄酒的感官品質造成負面影響。由本研究可知，菌株CS-1處理組脂肪酸類物質的含量略高于對照組，而其余處理組均低于對照組。萜烯類物質是葡萄酒品種香氣的主要貢獻者[36-38]，它們在葡萄酒中香氣閾值非常低，但即使濃度很低也很容易被人感知，其同樣對葡萄酒特征香氣的形成起到至關重要的作用。

4 結論

來源于葡萄酒中的4株植物乳桿菌（CS-1、XJ-14、XJ-25、XJA-2）均表現出良好的降酸能力和蘋果酸-乳酸發酵潛力，啟動發酵15 d內降酸約1.1 g·L-1，但均未完成蘋果酸-乳酸發酵。4株菌啟動蘋果酸-乳酸發酵所形成的香氣物質類別具有顯著差異。菌株XJ-25處理能夠顯著降低原酒中的生青味等不愉悅的香氣并帶來更加濃郁的花香及果香；XJ-14處理同樣能夠降低葡萄酒的生青味，但花香果香相對XJ-25較弱；菌株CS-1處理和菌株XJA-2處理均略微降低了原酒中的生青味，但化學味和植物味濃度的提升，掩蓋了原酒本身的花香和果香。整體來看，植物乳桿菌XJ-25處理所形成的香氣物質的增量及風味影響較好，且以品種香氣為主，因而具有開發為商業發酵劑的潛能。在今后的研究中，可對具有較好蘋果酸-乳酸發酵潛力的菌株進行基因工程上的改造，使其能夠開發為商業發酵劑。

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（責任編輯 趙伶俐）

Evaluation on Malolactic Fermentation Potential of Wine

BU Xiao1, XUE Xue2, CHENG Jing3, LIU ShuWen2,4,5

(1College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;3College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University/ Center for Viticulture and Enology, Beijing 100083;4Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, Shaanxi;5Viti-viniculture Experiment Station (Heyang) of Northwest A&F University, Weinan 715300, Shaanxi)

【Objective】For the development of wineas potential commercial malolactic fermentation (MLF) starter cultures, the process of MLF in Cabernet Sauvignon wine bywas investigated in this study, to evaluate the MLF potential of.【Method】This research usedCS-1, XJ-14, XJ-25 and XJA-2 (isolated from Xinjiang wine in authors’ lab with high glycosidase activity) as the research objects, and MLF in Cabernet Sauvignon wine, respectively, wine without MLF was set as the control group. The growth of strains, changes of malic acid content through the MLF, and the differences of wine aroma compositions before and after MLF were compared. Through analysis of the above three indicators to evaluate the MLF potential ofmore comprehensively.【Result】During the first 6 days of the MLF process, the density of 4 strains ofdecreased significantly, while the trend was began to slow down after inoculation for 6 days. All the strains showed a good deacidification ability. The deacidification ability of strain XJA-2 was slightly higher than other strains, and the concentration of malic acid in wine was decreased from 2.3 g·L-1to 1.0 g·L-1in 15 days, but all the strains failed to complete the MLF. Strain XJ-25 treatment could significantly reduce the unpleasant aroma of green and bring more rich floral and fruity, strainXJ-14 could also reduce the green flavor of wine, but the floral aroma was relatively weaker than strain XJ-25, while strain CS-1 and strain XJA-2 slightly reduced the green flavor of wine, but due to the increase of chemical and vegetal flavor, the floral and fruity of wine was covered.【Conclusion】UsingXJ-25 to start MLF could release the alcohol ester aroma substances more easily, to enhance the fruit and floral characteristics of wine. This strain was more advantageous to improve the quality of wine aroma compared with using other threestrains. Therefore,XJ-25 has the potential of development of commercial starter cultures.

; malolactic fermentation; wine; deacidification; aroma

2016-06-20；接受日期：2016-12-27

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD31B07）、國家現代農業產業技術體系建設專項（nycytx-30-ch-03）

卜瀟，E-mail：buxiao@nwsuaf.edu.cn。 通信作者劉樹文，E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn