谷胱甘肽修飾CdTe量子點(diǎn)與牛血紅蛋白相互作用的研究

趙玲子，汪閱，楊炳君

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谷胱甘肽修飾CdTe量子點(diǎn)與牛血紅蛋白相互作用的研究

趙玲子，汪閱，楊炳君

（吉林師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 四平 136000）

量子點(diǎn)是一種新型納米材料，其生物毒性及其環(huán)境影響日益受到社會(huì)的關(guān)注。通過(guò)紫外可見(jiàn)光譜和熒光光譜相互驗(yàn)證，研究谷胱甘肽修飾CdTe量子點(diǎn)和牛血紅蛋白的相互作用。結(jié)果表明，CdTe量子點(diǎn)與牛血紅蛋白的作用微弱，牛血紅蛋白光譜特性的變化主要是由于微環(huán)境的改變引起的。這將為從分子水平上研究量子點(diǎn)的生物毒性提供理論依據(jù)。

谷胱甘肽； 碲化鎘量子點(diǎn)； 牛血紅蛋白(BHb）

量子點(diǎn)又稱(chēng)為半導(dǎo)體納米晶體，是一種新型無(wú)極熒光探針[1]，具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)，發(fā)射峰可控且窄而對(duì)稱(chēng)，量子產(chǎn)率高，抗光漂白性強(qiáng)等優(yōu)良的熒光特性[2]，常作為生物標(biāo)記物和成像媒介被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)藥和生物等領(lǐng)域[3-5]。

隨著量子點(diǎn)應(yīng)用日漸廣泛，人們逐漸意識(shí)到其存在的潛在危害，研究表明，量子點(diǎn)的毒性作用除了歸因于其尺寸效應(yīng)[6]，其合成材料、合成方法不同導(dǎo)致的化學(xué)性質(zhì)的變化也是關(guān)鍵因素[7]，這使得對(duì)于量子點(diǎn)的生物毒性評(píng)價(jià)和比較變得復(fù)雜。目前，有關(guān)量子點(diǎn)與生物大分子相互作用已經(jīng)有很多研究報(bào)道[8，9]，但這些研究大多數(shù)都沒(méi)有考慮到熒光內(nèi)濾現(xiàn)象，而熒光內(nèi)濾的存在會(huì)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)很大的誤差，從而得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

本文將會(huì)在考慮熒光內(nèi)濾效應(yīng)的情況下，選取血液循環(huán)系統(tǒng)中的血紅蛋白為研究對(duì)象，運(yùn)用熒光光譜和紫外可見(jiàn)吸收光譜等手段對(duì)量子點(diǎn)與牛血紅蛋白的相互作用進(jìn)行研究，為量子點(diǎn)的生物毒性研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

Na2TeO3（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），谷胱甘肽、牛血紅蛋白（純度大于99%，美國(guó)Sigma公司），NaBH4（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CdCl2·2.5H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、異丙醇均為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；熒光分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，上海科升儀器有限公司）。

1.3 量子點(diǎn)的合成

在三口燒瓶中依次加入6 ml 0.1 mol/L的CdCl2、還原型谷胱甘肽0.225 0 g。用1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH值到9，加入少量水，之后加入0.100 0 g的NaBH4以及一定量的Na2TeO3，定容至100 mL，10 min將三口燒瓶置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中100 ℃加熱回流2 h。取剛剛制備的量子點(diǎn)溶液，加入2倍體積的異丙醇，用移液槍吹打均勻后，移至離心機(jī)中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速到6 000 r/min，離心時(shí)間10 min，棄掉上層清液，用超純水分散后備用。

1.4 量子點(diǎn)與BHb相互作用的紫外可見(jiàn)吸收光譜測(cè)定

將0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O按81∶19的比例混合，配制成pH為7.4的緩沖溶液。將1 mL的0.2 mol/L的PBS緩沖溶液，1 mL 3×10-5mol/L的BHb溶液以及一定濃度梯度的CdTe量子點(diǎn)溶液加入到10 mL容量瓶中，加水定容，穩(wěn)定30 min后，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。參數(shù)設(shè)置：掃描速度為快速，波長(zhǎng)范圍250~450 nm，狹縫寬度1 nm。

1.5 量子點(diǎn)與BHb相互作用的熒光光譜測(cè)定

取6個(gè)10 mL的容量瓶，分別加入1 mL pH為7.4的PBS緩沖溶液，然后再分別加入一定濃度梯度的CdTe量子點(diǎn)溶液，之后各加入1 mL的3×10-5mol/L的BHb溶液，加入超純水定容，穩(wěn)定30 min，對(duì)體系進(jìn)行熒光光譜的檢測(cè)。

熒光發(fā)射光譜參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)278 nm，掃描范圍290~450 nm，掃描電壓700 V，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。同步熒光參數(shù)設(shè)置：初始激發(fā)波長(zhǎng)250 nm，波長(zhǎng)差分別為15 nm(酪氨酸)和60 nm(色氨酸)。

1.6 熒光內(nèi)濾的計(jì)算

熒光內(nèi)濾是指溶液對(duì)激發(fā)和發(fā)射光的吸收所形成的熒光下降[10]。因此，為更清晰的解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，需要去掉熒光內(nèi)濾的影響，采用Lakowicz的校正公式校正熒光光譜的數(shù)值[11]：

cor=obs×10（ex+em）/2 （1）

式中：cor——校正后的熒光數(shù)值；

obs——測(cè)定的熒光數(shù)值；

ex——激發(fā)波長(zhǎng)處的吸收值；

em——發(fā)射波長(zhǎng)處的吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 量子點(diǎn)對(duì)BHb紫外可見(jiàn)吸收光譜的影響

BHb在278 nm和406 nm處有兩個(gè)顯著的吸收峰，它們分別是蛋白質(zhì)分子中含苯環(huán)的氨基酸殘基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）的吸收峰和血紅素的特征峰。由圖1可以看出，隨著量子點(diǎn)濃度的增加，兩個(gè)吸收峰的強(qiáng)度均逐漸減弱，但下降的幅度不大，說(shuō)明量子點(diǎn)與血紅蛋白發(fā)生了微弱的相互作用。

圖1 不同濃度CdTe量子點(diǎn)暴露下BHb的紫外吸收光譜

Conditions: BHb: 3×10-5mol L-1; CdTe QDs/×10-7mol L-1: (1) 0, (2) 0.207, (3) 0.414, (4) 0.828. pH=7.4

2.2 量子點(diǎn)對(duì)BHb熒光光譜的影響

熒光猝滅是指能夠?qū)е聼晒夤w熒光強(qiáng)度降低的物理或化學(xué)過(guò)程，由于其高度的靈敏性被廣泛地用于化學(xué)及生物化學(xué)的定量分析中。熒光猝滅分析中一個(gè)重要且不能避免的問(wèn)題就是猝滅劑對(duì)熒光體發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的吸收，這會(huì)導(dǎo)致猝滅率虛高的現(xiàn)象，被稱(chēng)為內(nèi)濾效應(yīng)。內(nèi)濾效應(yīng)會(huì)影響對(duì)于結(jié)果的分析，因此有必要對(duì)內(nèi)濾效應(yīng)進(jìn)行校正，否則觀察和計(jì)算出的結(jié)果會(huì)有很大的差異。

圖2為未進(jìn)行內(nèi)濾校正時(shí)CdTe量子點(diǎn)對(duì)BHb熒光光譜光譜的影響，由圖可以看出隨著CdTe量子點(diǎn)濃度的增加，BHb熒光強(qiáng)度逐漸下降，且峰值變化幅度很大，說(shuō)明CdTe量子點(diǎn)與BHb存在著顯著的相互作用。

圖2 不同濃度CdTe量子點(diǎn)暴露下BHb的熒光發(fā)射光譜

（無(wú)內(nèi)濾校正）

Conditions: BHb: 3×10-5mol L-1; CdTe QDs/×10-7mol L-1: (a) 0, (b) 0.207, (c) 0.414, (d) 0.621, (e) 0.828, (f) 1.035. pH=7.4; T﹦298 K

圖3 不同濃度CdTe量子點(diǎn)暴露下BHb的熒光發(fā)射光譜

（內(nèi)濾校正后）

由圖3可知，當(dāng)考慮熒光內(nèi)濾時(shí)，隨著CdTe量子點(diǎn)濃度的增加，BHb 340 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度變化幅度減小，且峰位置沒(méi)有變化，說(shuō)明CdTe量子點(diǎn)與BHb的相互作用是微弱的，其發(fā)射峰強(qiáng)度的變化主要是由于BHb所處微環(huán)境的改變引起的。

2.3 同步熒光光譜分析

由圖4、5可以看出，當(dāng)考慮熒光內(nèi)濾時(shí)，BHb中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光峰值變化的幅度很小，再次說(shuō)明量子點(diǎn)與BHb的相互作用很微弱。

圖4 不同濃度CdTe量子點(diǎn)暴露下BHb的同步熒光光譜(Δλ=60 nm)（內(nèi)濾校正后）

圖5 不同濃度CdTe量子點(diǎn)暴露下BHb的同步熒光光譜 (Δλ=15 nm)（內(nèi)濾校正后）

3 結(jié) 論

本文主要運(yùn)用紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜手段研究了CdTe量子點(diǎn)與BHb的相互作用。研究表明，隨著CdTe量子點(diǎn)濃度的增加，BHb的兩個(gè)吸收峰強(qiáng)度均逐漸下降，但下降幅度不大，這說(shuō)明量子點(diǎn)與牛血蛋白發(fā)生了微弱的相互作用。熒光光譜分析結(jié)果顯示，不考慮熒光內(nèi)濾的條件時(shí)，BHb的熒光特征峰強(qiáng)度隨量子點(diǎn)濃度的增加出現(xiàn)大幅下降，說(shuō)明二者相互作用顯著；當(dāng)考慮熒光內(nèi)濾時(shí)，BHb的熒光特征峰強(qiáng)度變化幅度很小，說(shuō)明實(shí)際情況是碲化鎘量子點(diǎn)與BHb雖然發(fā)生了相互作用，但反應(yīng)微弱，BHb熒光強(qiáng)度的變化，主要是微環(huán)境的變化所引起的。從整個(gè)實(shí)驗(yàn)中也證明了考慮熒光內(nèi)濾的重要性。

［1］陳海燕，胡琴. 量子點(diǎn)作為熒光探針在生物樣品檢測(cè)中的應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2015, 46 (2) :207-211.

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［11］Lakowicz J R. Principles of fluorescence spectroscopy [M]. Springer Verlag, 2006．

Study on the Interaction Between Glutathione Modified CdTe Quantum Dots and Bovine Hemoglobin

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（College of Environmental Science and Engineering, Jilin Normal University, Jilin Siping 136000, China）

Quantum dot is a new type of nanometer material, its biological toxicity effect and impact on the environment increasingly attract the attention of society. In this paper, the interaction between GSH modified CdTe quantum dots and bovine hemoglobin was studied by UV-visible spectra and fluorescence spectra. The results showed that the interaction between CdTe quantum dots and bovine hemoglobin was weak, and the change of the spectral characteristics of bovine hemoglobin was mainly due to the change of microenvironment. This paper will provide a theoretical basis for studying the biotoxicity of quantum dots at the molecular level.

glutathione; CdTe quantum dots; bovine hemoglobin (BHb)

TQ 033

A

1004-0935（2017）10-0951-03

2017-08-30

趙玲子（1984-），女，講師，碩士，山東淄博人，2010年畢業(yè)于山東大學(xué)環(huán)境科學(xué)專(zhuān)業(yè)，研究方向：環(huán)境污染與健康。