兩種HPLC法測定沙丁胺酮的對比

王鑫，孫銀玲，劉宏大，薛雁，邸偉慶

兩種HPLC法測定沙丁胺酮的對比

王鑫，孫銀玲，劉宏大，薛雁，邸偉慶

（遼寧遠大諾康生物制藥有限公司，遼寧 沈陽 110171）

目的 建立硫酸沙丁胺醇原料藥中沙丁胺酮的HPLC檢測方法。方法 采用《中華人民共和國藥典》2015版中硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑中雜質沙丁胺酮的測定方法和《歐洲藥典》9.0中收載的原料藥中雜質沙丁胺酮收載的測定方法進行比較，選取適用的方法并進行方法學驗證。結果 兩種HPLC方法均能檢測原料藥中沙丁胺酮含量，但《中華人民共和國藥典》2015版中的方法分離效果更佳。結論 優選《中華人民共和國藥典》2015版收載的HPLC方法作為硫酸沙丁胺醇原料藥中沙丁胺酮的檢測方法。

高效液相色譜法；硫酸沙丁胺醇；沙丁胺酮；方法學

硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate結構式見圖1）為選擇性β2受體激動劑，適用于支氣管哮喘、喘息性交氣管炎患者[1-5]。它能選擇性激動支氣管平滑肌的β2受體，松弛平滑肌，有較強的支氣管擴張作用。沙丁胺酮（Salbutamol Ketone結構式見圖1）為硫酸沙丁胺醇合成過程中的中間體還原不徹底產生的雜質，其結構式與硫酸沙丁胺醇接近，所以在檢測時沙丁胺酮與硫酸沙丁胺醇較難分離，本實驗目的是建立硫酸沙丁胺醇原料藥中沙丁胺酮的HPLC檢測方法。

圖1 硫酸沙丁胺醇與沙丁胺酮的化學結構式

《歐洲藥典》[6]（EP9.0）、《日本藥典 》[7]（JP15）、《美國藥典》[8]（USP40）、《英國藥典》[9]（BP2013）和《中華人民共和國藥典》[10]（Ch.p2015）均收載了硫酸沙丁胺醇原料藥。其中Ch.p2015使用紫外-可見分光光度法對雜質沙丁胺酮進行控制。JP15、USP40中有關物質檢測方法為薄層法且沙丁胺酮作為未知雜質進行控制。EP9.0、BP2013使用相同HPLC法測定有關物質但沙丁胺酮作為未知雜質進行控制。在該方法中雜質J為沙丁胺酮，該方法可以檢出沙丁胺酮。在Ch.p2015中硫酸沙丁胺醇相關制劑中只有硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑的標準中含有沙丁胺酮檢項，并且檢驗方法為HPLC法。為了有效控制硫酸沙丁胺醇原料藥中的沙丁胺酮含量，現分別采用上述方法中的EP9.0有關物質檢測方法及Ch.p2015硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑中沙丁胺酮的檢測方法對硫酸沙丁胺醇原料藥中沙丁胺酮進行檢測并比較。

1 實驗部分

島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；分析天平（瑞士Mettler toledo）；pH計(美國Eutech Instrument）。

沙丁胺酮對照品EP:SALBUTAMOL IMPURITY J CRS(LOT：Y0001186)(European Pharmacopoeia Reference Standard)；硫酸沙丁胺醇原料藥（批號：CPC-007-1402009；常州亞邦制藥有限公司），甲醇、乙腈（色譜級，美國fisher）；異丙醇（色譜級，Burdick Jackson）；磷酸二氫鈉，磷酸，三乙胺，乙酸銨，冰醋酸（國藥集團藥業控股有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

方法一：Ch.p2015硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑中沙丁胺酮檢測液相方法如下：色譜柱：Hypersil Gold C8柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：以異丙醇/moL·L-1醋酸銨緩沖液（pH4.5）（1.5; 98.5）為流動相A，異丙醇為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長：276 nm，柱溫：40 ℃。

表1 流動相梯度洗脫的時間程序

方法二：EP9.0中硫酸沙丁胺醇原料藥有關物質方法如下：色譜柱：Hypersil Gold C8柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：取3.45 g一水合磷酸二氫鈉至1 000 mL容量瓶中，加0.05%三乙胺溶液900 mL，用稀磷酸調Ph 3.0，用0.05%三乙胺稀釋至刻度作為流動相A，甲醇-乙腈：35~65作為流動相B，按表2進行梯度洗脫；檢測波長：273 nm，柱溫：30 ℃。

表2 流動相梯度洗脫的時間程序

2.2 系統適用性試驗

取雜質沙丁胺酮及硫酸沙丁胺醇原料藥各適量，精密稱定。以庚烷磺酸鈉溶液［取庚烷磺酸鈉2.87 g與磷酸二氫鉀2.5 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸溶液（1→2）調節pH值至3.65］-乙腈（78∶22）為溶液A，用溶液A作為稀釋液溶解并定量制成每1 mL中約含沙丁胺酮0.8 μg、硫酸沙丁胺醇0.4 mg的混合溶液，作為供試品溶液。分別在方法一和方法二條件下進行檢測。方法一，沙丁胺酮與硫酸沙丁胺醇的分離度為2.28；方法二，沙丁胺酮與硫酸沙丁胺醇的分離度為1.43，峰谷比為3.8；歐洲藥典9.0方法中要求沙丁胺酮和硫酸沙丁胺醇的峰谷比最小值為2.0。方法二中沙丁胺酮與硫酸沙丁胺醇分離度不佳，所以選用方法一對硫酸沙丁胺醇原料藥中沙丁胺酮進行檢測。

2.3 溶液制備

2.3.1 供試品溶液制備

取硫酸沙丁胺醇原料藥約20 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用“2.2”條中的稀釋液溶解并定容，搖勻，制成每1 mL中約含硫酸沙丁胺醇0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3.2 對照溶液的制備

稱取沙丁胺酮對照品適量，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中含沙丁胺酮0.8 μg的溶液，作為雜質對照溶液。

2.4 專屬性試驗

硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg 3份，分置于50 mL量瓶中，加3 mol·L-1鹽酸溶液6 mL于85 ℃水浴中加熱2.5 h、3 mol·L-1氫氧化鈉溶液3 mL于85 ℃水浴中加熱2 h、200 g·L-1過氧化氫溶液1 mL于85 ℃水浴中加熱2 h，酸堿破壞樣品分別經3 mol·L-1氫氧化鈉溶液和3 mol·L-1鹽酸溶液中和后用“2.2”條中的稀釋液稀釋至刻度，氧化破壞用“2.2”條中的稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為酸、堿、氧化破壞樣品溶液；另取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg，于130 ℃烘箱中加熱1.5 h，冷卻，用“2.2”條中的稀釋液溶解并稀釋至50 mL，搖勻，作為熱破壞樣品溶液；另取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg，置于50 mL量瓶中，用“2.2”條中的稀釋液溶解并定容，搖勻，置4 500±500 lx光照培養箱中照射5 d，作為光破壞樣品溶液。取上述各破壞樣品溶液，經微孔濾膜濾過后測定。HPLC圖譜見圖2。結果由圖2可知，本品經酸破壞、堿破壞、氧化破壞、熱破壞、光破壞后，沙丁胺酮與主成分峰均獲得基線分離。另取空白溶劑，同法試驗，結果，空白溶劑對本品沙丁胺酮檢查無干擾。

圖2 空白溶劑（A）、及硫酸沙丁胺醇酸破壞（B）、堿破壞（C）、氧化破壞（D）、熱破壞（E）、光破壞（F）、產物和供試品（G）的HPLC圖譜

2.5 線性關系考察與范圍的確定

取沙丁胺酮對照品約10 mg，精密稱定，置于250 mL量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，作為沙丁胺酮對照儲備液；

精密量取沙丁胺酮對照品儲備液0.25 mL置于250 mL量瓶中，另外取1、2、3、4和5 mL，分置于50 mL量瓶中，用水定容，搖勻，依法測定，量取峰面積。以質量濃度（，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標分別進行線性回歸，繪制標準曲線，所得回歸方程為=58 881-2 064，2=0.999，在0.04～4μg·mL-1范圍內線性關系良好。結果表明，沙丁胺酮在試驗的質量濃度范圍內，線性關系良好。

2.6 定量限和檢測限的確定

取“2.5”條下的沙丁胺酮對照儲備液，經逐步稀釋后測定，以信噪比（S/N）≈10時的質量濃度（或進樣量）為定量限、S/N≈3時的質量濃度（或進樣量）為檢測限。結果顯示：沙丁胺酮的定量限約為0.8 ng，檢測限約為0.24 ng。

2.7 精密度試驗

取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg 6份，精密稱定，分置于50 mL量瓶中，在6份樣品中加入“2.5”條下的沙丁胺酮對照儲備液1 mL，加“2.2”條中的稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。依法測定，量取峰面積按外標法計算， 6份樣品測定結果的相對標準偏差（RSD）為0.48%，表明方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

2.8.1 沙丁胺酮對照品穩定性考察

取“2.5”條下的沙丁胺酮對照儲備液1 mL，以水定容至50 mL量瓶中，作為對照品溶液。分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8 、10、12和24 h后取樣測定，以峰面積計算RSD值。結果：RSD%為0.12%，結果表明：沙丁胺酮對照品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8.2 硫酸沙丁胺醇樣品穩定性考察

取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，在樣品中加入“2.5”條下的沙丁胺酮對照儲備液1 mL，加“2.2”條中的稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8 、10、12和24 h后取樣測定，按外標法以峰面積計算沙丁胺酮含量。RSD%為0.44%，結果表明：硫酸沙丁胺醇供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 回收率試驗

取硫酸沙丁胺醇原料藥約20 mg共9份，精密稱定，分置于50 mL量瓶中，分別精密加入沙丁胺酮對照儲備液0.8、1.0、1.2 mL各3份，分別用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，制成低（0.64 μg·mL-1）、中（0.80 μg·mL-1）、高（0.96μg·mL-1）3個質量濃度的供試溶液。另精密量取沙丁胺酮對照儲備液1.0 mL，置于50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。另取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用“2.2”條中的稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為本底校正溶液。精密量取供試溶液、對照溶液和本底校正溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算供試溶液和本底校正溶液中沙丁胺酮含量，并計算沙丁胺酮的回收率，即以供試溶液的含量扣除本底校正溶液的含量后與加入量比較即得。沙丁胺酮平均回收率為100.1%，RSD%為0.6%（=9），具體數據見表3。

表3 回收率結果

2.10 耐用性考察

取硫酸沙丁胺醇原料藥20 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，在樣品中加入“2.5”條下的沙丁胺酮對照儲備液1 mL，加“2.2”條中的稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。通過考察改變色譜條件變量包括色譜柱、流速、pH、柱溫觀察檢測結果不受影響的程度，結果表明該方法耐用性良好。具體數據見表4。

2.11 樣品沙丁胺酮的測定

取硫酸沙丁胺醇原料藥約20 mg 3份，精密稱定。分別置于50 mL量瓶中，用“2.2”條中的稀釋液溶解并定容，搖勻，制成每1 mL中約含硫酸沙丁胺醇0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。取沙丁胺酮對照品適量，用水溶解并定量稀釋制成每1 mL中含沙丁胺酮0.8μg的溶液，作為雜質對照品溶液。精密量取供試溶液和雜質對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

表4 耐用性結果

供試品溶液的色譜圖中如有與沙丁胺酮保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算，沙丁胺酮不得過0.2%。經對3批樣品測定，結果見表5。通過結果可知，本樣品未檢出沙丁胺酮雜質。

表5 硫酸沙丁胺醇中沙丁胺酮測定結果（%）

3 結論

采用HPLC法檢測硫酸沙丁胺醇原料藥中的沙丁胺酮，由于方法靈敏度高，得到的結果更加準確；《歐洲藥典》9.0中有關物質方法，沙丁胺酮作為考察系統適用性的對照品，要求與硫酸沙丁胺醇的峰谷比最小值為2，通過實驗發現可以達到該要求，但是分離度沒有達到1.5，與《中華人民共和國藥典》2015版硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑中檢測沙丁胺酮的方法比較，中國藥典方法分離度更優，通過對中國藥典的方法學考察發現，該方法在質量濃度0.04～4 μg·mL-1范圍內線性關系良好；加樣回收率平均值100.1%，RSD%為0.6%（=9）；精密度、穩定性及耐用性試驗的RSD均小于2.0%。該方法具有準確、可靠、靈敏度高等特點，可作為硫酸沙丁胺醇原料藥中沙丁胺酮的檢測方法。

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［2］陳德暉，翟鶯鶯，林育能，等．吸入用布地奈德混懸液聯合硫酸沙丁胺醇氣霧劑霧化吸入治療急性期COPD的臨床效果[J]．中國當代醫藥，2015，22（33）：967-970．

［3］戚宇飛，吐爾遜古力·布爾汗．硫酸沙丁胺醇在治療兒童支氣管哮喘中的臨床療效分析[J]．臨床兒科雜志，2011，29（10）：38-40．

［4］ 李延召. 鹽酸氨溴索聯合硫酸沙丁胺醇治療支氣管擴張臨床觀察[J]. 世界最新醫學信息文摘, 2016, 16 (59): 150-151.

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［6］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M].（2015年版二部）. 北京：中國醫藥科技出版社，2015.

［7］EUROPEAN PHARMACOPOEIA9.0 [S]. 3526-3528.

［8］The Japanese Pharmacopoeia ⅩⅥ [S]. 1369-1370.

［9］The United States Pharmacopoeia 40 [S]. 2606-2607.

［10］British Pharmacopoeia, 2013 [S]. 1-8.

Investigation on Two HPLC Determination Methods of Salbutamol Ketone

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（Liaoning Grand Nuokang Biopharmaceutical Co.,Ltd., Liaoning Shengyang 110171, China）

Objective: To establish HPLC method to determine salbutamol ketone in salbutamol sulfate raw material. Methods: the determination method of salbutamol ketone impurity in salbutamol sulfate aerosol in Ch.p 2015 and the determination method of salbutamol ketone impurity in APIs in EP9.0 were compared, and a suitable method was used carry out methodological validation. Results: Both HPLC methods can detect salbutamol ketone in APIs.The separation effect of method in Ch.p2015 is better than that in EP9.0.Conclusion: The HPLC method in Ch.p2015 should be used as the detection method for salbutamol ketone in APIs.

HPLC; sulfate salbutamol; salbutamol ketone; methodology

O 657

A

1004-0935（2017）10-1032-04

2017-07-25

王鑫（1984-），男，主管中藥師，碩士，遼寧省沈陽市人，2011年畢業于遼寧中醫藥大學，研究方向：藥物研發。

劉宏大（1979-），女，回族，碩士，研究方向：藥物研發。