二氯乙酸鈉對人骨肉瘤MG63細胞周期及凋亡影響的初步研究

于雅麗，王雷鳴

(鄭州市骨科醫院檢驗科，河南 鄭州 450052)

二氯乙酸鈉對人骨肉瘤MG63細胞周期及凋亡影響的初步研究

于雅麗，王雷鳴

(鄭州市骨科醫院檢驗科，河南 鄭州 450052)

目的 探討不同濃度的二氯乙酸鈉(DCA)對人骨肉瘤MG63細胞活性、周期及凋亡的影響。方法 用含質量分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養MG63細胞，不同濃度DCA作用于對數生長期的細胞，CCK8試劑盒檢測50、100、200 μg·mL-1DCA處理24 h、48 h后細胞增殖情況；流式細胞術檢測100、200 μg·mL-1DCA-Na作用24 h、48 h后細胞周期和凋亡情況；qRT-PCR檢測100、200 μg·mL-1DCA處理后細胞周期相關基因CDK2的變化。結果 CCK8檢測結果顯示50、100、200 μg·mL-1DCA均能抑制MG63細胞的生長，且有時間和濃度依賴性；不同濃度的DCA-Na分別干預MG63細胞不同時間后都明顯阻滯細胞于G2/M期，且細胞凋亡率增加(P均<0.001)；不同濃度的DCA干預MG63細胞后，細胞中的CDK2 mRNA的相對表達量明顯降低(P均<0.001)。結論 DCA通過抑制CDK2使MG63細胞阻滯于G2/M期，進而誘導細胞凋亡，抑制細胞的生長。

二氯乙酸鈉；骨肉瘤；周期蛋白依賴激酶；細胞周期

骨肉瘤是5～20歲青少年最常見的原發性惡性骨腫瘤[1-2]，其惡性程度高，肺轉移早，易復發，病死率約70%[3]，而其發病機制不明確，傳統化療藥物效果差，副作用大[4-5]，因此闡明其發病機制及找到治療的生物靶點刻不容緩。周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是細胞周期調控的中心環節[6]，而惡性腫瘤的生物學特點就是細胞周期的脫靶，使細胞無限的增殖，而大量的文獻證實骨肉瘤中CDK處于過表達或失去正常調控機制的狀態[7]，因此，通過抑制CDK活性來達到腫瘤細胞周期阻滯和凋亡[8]。已有文獻[9]證實二氯乙酸鈉(sodium dichloroacetate,DCA)通過抑制線粒體丙酮酸脫氫酶激酶后啟動三羧酸循環，促進葡萄糖的氧化磷酸化，而激活了線粒體介導的凋亡通路抑制人乳腺癌、非小細胞肺癌和膠質母細胞瘤細胞株的生長。研究[10]發現DCA通過誘導凋亡和阻滯細胞周期G2期在不影響非腫瘤細胞生長的情況下抑制結腸癌細胞生長，顯著降低結腸癌細胞增殖。而課題組先前的研究發現能量抑制劑的活性誘導骨肉瘤MG63細胞凋亡，抑制人骨肉瘤細胞MG63生長。為探討DCA是否也通過抑制了CDK2阻滯細胞于周期G2期來起作用，我們設計了此課題，觀察觀察不同濃度DCA作用于MG63細胞后對細胞活性及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤MG63細胞株由鄭州大學基礎醫學院提供。

1.2 試劑 CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司；Trizol細胞裂解液購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix購自Beyotime公司；流式細胞凋亡檢測試劑盒購自Beyotime公司；RPMI-1640培養基購自澳大利亞Gbico公司；DCA自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 方法 在加質量分數10%胎牛血清RPMI-1640培養基中培養人骨肉瘤細胞株MG63，pH值為6.8～7.2，于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱培養48 h后，用質量分數0.25%胰酶消化傳代。取生長旺盛的對數生長期細胞，制作細胞濃度為1×105·mL-1的細胞懸液，取100 μL轉種96孔培養板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，細胞貼壁后，棄去培養基，分別加入含DCA終濃度為50、100、200 μg·mL-1的培養基100 μL，對照組不加藥，每組設3個復孔。

培養24 h、48 h、72 h后每孔分別加入5 mg·mL-1的CCK-8溶液10 μL，混勻，將培養板置于培養箱內繼續孵育1～4 h，用酶標儀測定450 nm波長下測定吸光度值(OD值)，測3次，取平均值，依照抑制率公式相對抑制率=[1-(藥物干預實驗組OD值)/(對照組OD值)]×100%，計算各組抑制率。

Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測不同濃度DCA對細胞周期和細胞凋亡的影響取對數生長期細胞，常規消化制成單細胞懸液，以細胞濃度1.25×105·mL-1接種于細胞培養瓶中，24 h后加入不同濃度DCA-Na (100、200 μg·mL-1)培養24 h、48 h，收集細胞，離心5 min，棄去上清，體積分數70%冰乙醇固定，4 ℃過夜。檢測時，PBS清洗細胞，吹打混勻，加入Rnase 5 μL(10 mg·mL-1)，37 ℃放置1 h，加入2 μL Annexin V-FITC和2 μL PI染液，室溫避光染色30 min，計數10 000個細胞，FCW流式細胞術檢測細胞周期時相和凋亡情況，各組細胞均重復實驗3次，取其平均值。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)根據GenBank提供的CDK2序列合成引物Sense (5’-3’): 5’-CCGCCTGGACACTGAGACT-3’，Anti-Sense(3’-5’)：5’-GTGGAGGACCCGATGGA-3’，產物長度270 bp。然后，提取各組細胞總RNA，取qRT-PCR合成cDNA，qRT-PCR進行定量檢測mRNA的相對表達量。本次使用25 μL Real Time PCR反應體系，AB17500機器進行PCR反應。以2-△△Ct法計算CDK2基因mRNA相對表達差異，每組重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 不同濃度DCA對MG63細胞的活性抑制作用 50、100、200 μg·mL-1的DCA分別作用于MG63細胞后，其OD值均較對照組(0 μg·mL-1DCA)下降，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖1。

2.2 不同濃度DCA對MG63細胞周期的影響 流式細胞術結果提示不同濃度DCA作用24 h、48 h后細胞周期明顯阻滯于G2/M期，且有時間和濃度依賴性。見表1。

圖1 不同濃度DCK作用于MG63細胞后活性抑制曲線

DCA/(μg·mL-1)24h細胞周期G0/G1SG2/M48h細胞周期G0/G1SG2/M052.890±1.54037.260±1.9807.933±1.23464.124±2.32124.128±2.23111.573±2.36710049.023±1.09029.890±0.91218.236±1.98253.246±1.57627.256±1.87615.293±1.39220046.320±0.6107.401±0.90144.258±1.10245.354±2.15616.246±0.75239.012±1.982F19.234479.235512.32578.912349.012174.235P0.002<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：方差分析顯示，F24 h=7.102，P=0.004；F48 h=12.214，P<0.001。與0 μg·mL-1DCA比較，1)P<0.05；與100 μg·mL-1DCA比較，2)P<0.05

2.3 不同濃度的DCA對MG63細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，不同濃度的DCA處理后MG63細胞均呈現明顯的凋亡現象。見表2。

表2 不同濃度的DCA對MG63細胞凋亡的影響

注：與0 μg·mL-1DCA比較，1)P<0.05；與100 μg·mL-1DCA-Na比較，2)P<0.05

2.4 不同濃度的DCA對MG63細胞CDK2 mRNA相對表達量的影響 不同濃度的DCA干預MG63細胞后，細胞中的CDK2 mRNA的相對表達量明顯降低(P均<0.001)。見表3。

3 討論

CCK8實驗結果證明了，不同濃度的DCA抑制MG63細胞的活性，且具有時間和濃度依賴性。這提示，DCA能誘導腫瘤細胞的凋亡和抑制細胞周期，而流式細胞術結果顯示，不同濃度的DCA作用于MG63細胞24 h和48 h后，G2期的細胞明顯增多，而且隨著濃度的增加，G2期的細胞也增加，這說明DCA抑制腫瘤細胞的G2周期，這與文獻不符。Wong等[11]認為DCA激活線粒體介導的細胞凋亡通路是能通過激活丙酮酸脫氫酶活性啟動三羧酸循環，釋放大量的ATP，促進線粒體膜去極化、降低膜電位。而Cao等[12]認為DCA聯合化療藥能阻滯腫瘤細胞周期G1期并能增加腫瘤細胞的凋亡率，但是單獨DCA對細胞周期不起任何作用。我們的研究與Madhok等[10]的報道是一致的，他的研究是DCA誘導凋亡和阻滯期G2期抑制結腸癌細胞生長，顯著降低結腸癌細胞增殖，但不影響非腫瘤細胞生長。本實驗用不同濃度的DCA作用細胞24 h和48 h，然后提取RNA進行qRT-PCR，結果顯示，CDK2的表達明顯下調，說明DCA抑制CDK2的表達，但是否說明DCA通過抑制CDK2來進行細胞周期的調節，這需要進一步實驗。另外，我們的實驗也存在缺點，沒有進行非腫瘤細胞的對照，因此，我們的后續研究會進一步完善實驗過程，力求實驗結果真是可靠。總之，DCA通過抑制CDK2使MG63細胞阻滯于G2/M期，進而誘導細胞凋亡，抑制細胞的生長。

表3 不同濃度的DCA對MG63細胞CDK2 mRNA相對表達量的影響

注：與0 μg·mL-1DCA-Na比較，1)P<0.05；與100 μg·mL-1DCA-Na比較，2)P<0.05

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Effect of Sodium Dichloroacetate on Cell Cycle and Apoptosis of Human Osteosarcoma Cell Line MG63

YU Yali,WANG Leiming

(DepartmentofClinicalLaboratory,ZhengzhouCityOsteopathicHospital,Zhengzhou450052,China)

Objective To determine the effect of sodium dichloroacetate (DCA) on human osteosarcoma cell line MG63 in vitro activity,cell cycle and apoptosis.Methods The MG63 cells were cultured with RPMI-1640 medium including 10% of fetal bovine serum as usual,and treated with different concentration DCA. Then CCK8 kit was used to observe growth suppression of cells under different concentrations of DCA at 24 h,48 h; Flow cytometry assay was used to determine the cycle and apoptosis of the cells that were treated by different concentrations of DCA for 24 h,48 h,respectively. Finally,qRT-PCR was used to determine the mRNA relative expression of cell cycle related gene CDK2 after DCA invention.Results Different concentration of DCA inhibited cell growth and proliferation in a time-and dose-dependent manner; different concentration of DCA-Na acting on different time respectively arrested cell cycle G2/M phase,and improved apoptosis(P<0.001); and decreased the expression of CDK2 gene(P<0.001).Conclusion DCA can arrest G2/M cell cycle phase through inhibiting activity of CDK2,and then DCA induce apoptosis of MG63 cells and inhibit the growth of tumor cells.

sodium dichloroacetate; osteosarcoma; cyclin-dependent kinase; cell cycle

鄭州市科技計劃項目(編號：153PKJGG084)

于雅麗(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事骨肉瘤的基礎與臨床研究。E-mail：wa2yl@126.com

王雷鳴(1959-)，男，碩士，主任醫師，主要從事骨肉瘤的基礎與臨床研究。E-mail：wanglm3@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.002

R738.1

A

1673-5412(2017)01-0007-04

2016-07-20)