Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴(kuò)增表達(dá)與蒽環(huán)類藥物療效關(guān)系的研究

張成娟，董鳳梅，徐本玲，袁 鵬

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴(kuò)增表達(dá)與蒽環(huán)類藥物療效關(guān)系的研究

張成娟1，董鳳梅2，徐本玲1，袁 鵬1

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

目的 探討Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴(kuò)增表達(dá)與蒽環(huán)類藥物療效的關(guān)系。方法 207例經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌患者均接受FEC方案新輔助化療，并測(cè)定其Ki-67、Her-2及Top2A基因的表達(dá)。結(jié)果 207例乳腺癌患者中，Ki-67分級(jí)為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例；Her-2基因擴(kuò)增26例(12.6%)，未擴(kuò)增181例(87.4%)；Top2A基因擴(kuò)增26例(12.6%)，未擴(kuò)增181例(87.4%)。Ki-67分級(jí)與Her-2基因、Top2A基因擴(kuò)增無(wú)關(guān) (P>0.05)。Her-2、Top2A的擴(kuò)增與化療療效均呈正相關(guān)(r=0.59、0.58,P<0.05)。結(jié)論 Her-2、Top2A的表達(dá)對(duì)乳腺癌患者化療藥物的選擇及預(yù)后的判斷具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

Ki-67；Her-2；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα；乳腺癌；蒽環(huán)類藥物

近年來(lái)，乳腺癌已成為全世界威脅女性健康的第一大惡性腫瘤，其發(fā)病率正以每年5%的速度呈增長(zhǎng)狀態(tài)，且年輕、低齡化的趨勢(shì)越來(lái)越明顯[1-3]。在乳腺癌各種治療中，化療的地位較為重要，而腫瘤細(xì)胞存在的多藥耐藥現(xiàn)象是化療失敗的主要因素。蒽環(huán)類藥物作為乳腺癌化療較為傳統(tǒng)的一類藥物，近年來(lái)關(guān)于其急性不良反應(yīng)的報(bào)道較多，且有少數(shù)患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，提示部分蒽環(huán)類藥物選擇性不高的現(xiàn)狀[4]。因此，尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物敏感性的新的生物學(xué)標(biāo)志物質(zhì)，對(duì)臨床個(gè)體化治療手段的選擇尤為重要。目前人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(DNA topoisomerase Ⅱα，Top2A)及Ki-67在乳腺癌中的擴(kuò)增表達(dá)研究較少。因此本文通過(guò)對(duì)接受新輔助化療的乳腺癌患者中Ki-67、Her-2及Top2A的擴(kuò)增表達(dá)及其與蒽環(huán)類藥物療效的關(guān)系進(jìn)行研究，探討其能否成為預(yù)測(cè)蒽環(huán)類化療藥物療效的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2008年1月至2013年12月收治的207例接受新輔助化療的經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌患者，均為女性，年齡23～56(40±16)歲，參照TNM標(biāo)準(zhǔn)分期為Ⅱ期71例，Ⅲ期136例?；颊呷榉可暇嬖诳蓽y(cè)量的病灶，腫瘤直徑3～12 cm?；熐靶谐Ｒ?guī)血及心、肝、腎功能檢查，排除化療禁忌證者、年齡>56歲者以及不配合研究者。

1.2 化療方案的選擇 所有患者均采用FEC方案進(jìn)行化療：5-氟尿嘧啶500 mg·m-2，環(huán)磷酰胺500 mg·m-2，表阿霉素100 mg·m-2，均采取靜脈滴注，化療結(jié)束后3 d給予患者行療效評(píng)估。

1.3 Ki-67的檢測(cè) 采用Envision二步法，石蠟切片并脫蠟，放入乙二胺四乙酸修復(fù)液行修復(fù)5 min；行PBS沖洗，加入一抗過(guò)夜(4 ℃)。重復(fù)PBS沖洗，加入二抗40 min(37 ℃)；重復(fù)PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺液顯色，蘇木素-尹紅復(fù)染后封片行鏡下觀察。其中每張切片中選擇5個(gè)高倍視野，根據(jù)切片中所選視野的陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例進(jìn)行結(jié)果判定，其中<5%為陰性(-)、5%～<25%為弱陽(yáng)性(+)、25%～50%為陽(yáng)性(++)、>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 Her-2及Top2A基因表達(dá)的檢測(cè) 采用熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)Her-2、Top2A的基因表達(dá)。具體過(guò)程為：石蠟切片脫蠟，放入預(yù)處理液中10 min(95 ℃),胃蛋白酶孵育10 min(25 ℃)，雜交儀中變性5 min(80 ℃)后45 ℃雜交過(guò)夜，DAPI中顯色。100高倍鏡下觀察FISH結(jié)果并對(duì)腫瘤細(xì)胞核的信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果紅色信號(hào)的總數(shù)/綠色信號(hào)的總數(shù)比值≥2.2時(shí)，即為Her-2基因、Top2A基因擴(kuò)增;不超過(guò)1.8時(shí)為無(wú)擴(kuò)增; 1.8～2.2時(shí)，則需要再計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞核中的信號(hào)。

1.5 療效評(píng)估 療效按WHO制定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估，完全緩解(CR)：所有病灶均完全消失；部分緩解(PR)：靶病灶最大徑之和減少≥50%，至少維持30 d；疾病進(jìn)展(PD)：靶病灶最大徑之和至少增加≥25%，或出現(xiàn)新病灶。疾病穩(wěn)定(SD) 靶病灶最大徑之和縮小未達(dá)PR，或增大未達(dá)PD。以CR+PR為有效，以PD+SD為無(wú)效。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，等級(jí)計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67分級(jí)及其與Top2A、Her-2基因擴(kuò)增的關(guān)系 207例患者中，Ki-67分級(jí)為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例。Her-2基因擴(kuò)增26例(12.6%)，未擴(kuò)增181例(87.4%)；Top2A基因擴(kuò)增26例(12.6%)，未擴(kuò)增181例(87.4%)；Ki-67分級(jí)與Top2A基因、Her-2基因擴(kuò)增無(wú)關(guān)(χ2=1.28、1.33，P>0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 Ki-67分級(jí)及其與Top2A、Her-2基因擴(kuò)增的關(guān)系

2.2 乳腺癌患者Her-2及Top2A擴(kuò)增與含蒽環(huán)類藥物化療療效的關(guān)系 Her-2基因擴(kuò)增26例中有效為10例(38.5%)，無(wú)擴(kuò)增的118例患者中無(wú)有效病例出現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Top2A基因擴(kuò)增的26例患者中有效為21例(80.77%)，無(wú)擴(kuò)增的118例患者中有效為30例(16.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且Her-2、Top2A的擴(kuò)增與化療療效均呈正相關(guān)(r=0.59、0.58，P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 Her-2及Top2A基因在乳腺癌患者中的擴(kuò)增情況

A:Her-2基因在乳腺癌上無(wú)擴(kuò)增，紅色信號(hào)的Her-2基因與綠色信號(hào)的CEN17比值<1.8；B:Her-2基因在乳腺癌上擴(kuò)增，紅色信號(hào)的Her-2基因與綠色信號(hào)的CEN17比值≥2.2；C:Top2A基因在乳腺癌上無(wú)擴(kuò)增，紅色信號(hào)的Top2A基因與綠色信號(hào)的CEN17比值<1.8；D: Top2A基因在乳腺癌上無(wú)擴(kuò)增，紅色信號(hào)的Top2A基因與綠色信號(hào)的CEN17比值不低于2.2

表2 乳腺癌患者Her-2及Top2A擴(kuò)增與含蒽環(huán)類藥物化療療效的關(guān)系

3 討論

乳腺癌新輔助化療針對(duì)腫瘤，可有效縮小其病灶范圍，提高保乳治療的效果及概率，針對(duì)化療后的腫瘤變化，能夠及時(shí)調(diào)整方案，使得該病的治療更有選擇及針對(duì)性，效果較為明顯。含蒽環(huán)類藥物的治療方案是目前最為常用的方案之一。

Top2A作為調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化、控制核酸生理功能的一種關(guān)鍵酶，在多種細(xì)胞的酶類中均有存在，且在增殖細(xì)胞中呈現(xiàn)有周期特異性表達(dá)。Top2A在腫瘤增殖的不同細(xì)胞周期中表達(dá)各異，一般表現(xiàn)為在DNA復(fù)制后期及有絲分裂期延長(zhǎng)，有絲分裂期結(jié)束后表達(dá)有所下降，提示腫瘤增殖受Top2A表達(dá)的影響[5]。目前較為一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，Her-2蛋白的過(guò)表達(dá)與基因擴(kuò)增存在一定的相關(guān)性，且Her-2與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系較為密切[6]。

有學(xué)者認(rèn)為位于17q12-21基因座的基因，可能在調(diào)節(jié)乳腺癌對(duì)藥物的反應(yīng)性中起作用[7-8]。作為蒽環(huán)類藥物重要的作用靶點(diǎn)之一，Top2A基因的擴(kuò)增或缺失可影響蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)及其藥效。Top2A陽(yáng)性表達(dá)可提示患者的預(yù)后不良，對(duì)患者的預(yù)后評(píng)估比較重要[9-11]。另外，Her-2基因突變可導(dǎo)致基因擴(kuò)增表達(dá)過(guò)度，引起Top2A基因出現(xiàn)異常，Her-2狀態(tài)對(duì)預(yù)測(cè)蒽環(huán)類化療藥物的化療效果尚無(wú)統(tǒng)一定論。Ki-67在臨床監(jiān)測(cè)中也較為重要，其高水平的表達(dá)可提示細(xì)胞增殖活動(dòng)較為活躍，表明此類患者的預(yù)后不良。新輔助化療后Ki-67表達(dá)的下降可反映腫瘤細(xì)胞的減少及對(duì)化療的敏感程度，并有利于乳腺癌的預(yù)后[12-13]。有學(xué)者通過(guò)對(duì)385例化療前核心穿刺標(biāo)本、新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本的Ki-67檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新輔助化療前后Ki-67的陽(yáng)性細(xì)胞百分比的改變可作為影響預(yù)后的因素[14-17]。而本研究中Ki-67的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，提示Ki-67蛋白表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性不明顯，可能與本研究的研究例數(shù)、治療時(shí)間有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，207例患者中，Ki-67分級(jí)為(-)32例，(+)58例，(++)95例，(+++)22例；Her-2基因擴(kuò)增26例(12.6%)，未擴(kuò)增181例(87.4%)；Top2A基因擴(kuò)增26例(12.6%)，未擴(kuò)增181例(87.4%)，Ki-67分級(jí)與Top2A基因、Her-2基因擴(kuò)增無(wú)關(guān)(P>0.05)。另外，HER-2基因擴(kuò)增26例中有效為10例(38.5%)，無(wú)擴(kuò)增的118例患者中無(wú)有效病例出現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Top2A基因擴(kuò)增的26例患者中有效為21例(80.77%)，無(wú)擴(kuò)增的118例患者中有效為30例(16.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且Her-2的擴(kuò)增、Top2A的擴(kuò)增與化療效果均呈正相關(guān)(r=0.59、0.58，P<0.05)，可見(jiàn)Top2A對(duì)療效影響的相關(guān)系數(shù)高于Her-2對(duì)療效影響的相關(guān)系數(shù)，提示Top2A擴(kuò)增時(shí)，對(duì)含蒽環(huán)類化療藥物敏感性較高，化療獲益較大，蒽環(huán)類化療藥物的療效更好，Top2A可能比Her-2對(duì)蒽環(huán)類藥物更有預(yù)測(cè)作用?？赡艿脑蚍治鰹椋篐er-2可能并不能直接預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)性，Her-2和蒽環(huán)類藥物效能的關(guān)系可能依賴于Top2A的同時(shí)擴(kuò)增，并且Her-2激活可以直接增加Top2A的活性。

綜上所述，通過(guò)對(duì)乳腺癌中Ki-67、Her-2基因、Top2A基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，Her-2、Top2A基因不僅可以對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行較為準(zhǔn)確的個(gè)體化分析和評(píng)價(jià)，Ki-67的表達(dá)較不明顯?？蓪er-2基因、Top2A基因作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于降低腫瘤對(duì)蒽環(huán)類藥物耐藥性，提高化療藥物的敏感性，最終達(dá)到提高乳腺癌患者無(wú)病生存期和總生存期的目的有一定作用。

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Relationship Between Ki-67,Her-2 and Top2A Amplification in the Breast Cancer and Efficacy of Anthracycline-based Regimen

ZHANG Chengjuan1,DONG Fengmei2,XU Benling1,YUAN Peng1

(1.HenanProvincialTumorHospital,Zhengzhou450008,China;2.ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou450007,China)

Objective To explore the relationship of Ki-67,Her-2 and Top2A amplification in the breast cancer and efficacy of anthracycline-based regimen.Methods The 207 patients with breast cancer confirmed by pathology underwent the FCC regimen neoadjuvant chemotherapy,and the Ki-67,Her-2,Top2A gene expressions were detected.Results Among the 207 patients,Ki-67 classification of (-) were 32 patients,58 patients were (+),95 patients were (++),22 patients were (+++).Her-2 gene amplification were 26 patients (12.6%),no-amplification were 181 patients (87.4%).Top2A gene amplification were 26 patients (12.6%),no-amplification were 181 patients (87.4%).Ki-67 classification was unrelated with the amplification of Her-2 and Top2A genes (P>0.05).Her-2 and Top2A amplification were positive correlated with the effect of chemotherapy (r=0.59,0.58;P<0.05).Conclusion The expression of Her-2 and Top2A has important guiding value in the selection of chemotherapy drugs and prognosis of patients with breast cancer.

Ki-67; human epidermal growth factor receptor 2; DNA topoisomerase Ⅱα; breast cancer; augmentation; anthracycline-based drugs

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81602637)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：162102410046)

張成娟(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤靶向治療相關(guān)基因檢測(cè)及其臨床應(yīng)用的研究工作。E-mail：zcj2016@126.com

袁鵬(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺癌的診治及其分子靶點(diǎn)研究工作。E-mail：yuanpeng117@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.003

R737.9；R730.53

A

1673-5412(2017)01-0011-04

2016-10-21)