肝癌中CpG甲基化與microRNA-34沉默的研究

林 蘭，劉繼斌

(南通市腫瘤醫(yī)院，江蘇 南通 226361)

肝癌中CpG甲基化與microRNA-34沉默的研究

林 蘭，劉繼斌

(南通市腫瘤醫(yī)院，江蘇 南通 226361)

目的 探討肝癌中miR-34家族甲基化的價值。方法 入組經(jīng)病理組織學(xué)確診的43例原發(fā)性肝癌手術(shù)病例以及臨近癌旁組織，使用甲基化特異性PCR(MSP)方法分析miR-34在肝癌組織和癌旁組織中的甲基化狀態(tài)，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR法驗證MSP結(jié)果。結(jié)果 肝癌組織中miR-34a和miR-34b/c甲基化頻率啟動分別為72.1%和79.1%，均高于癌旁組織(P<0.05)；miR-34a和miR-34b/c在肝癌組織中明顯比癌旁組織表達下調(diào)(P<0.05)；肝癌組織中miR-34b表達與CpG甲基化呈負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 肝癌組織中DNA甲基化可能參與了miR-34b的失活。

微小RNA-34；甲基化；肝癌

原發(fā)性肝癌是全球最為常見的惡性腫瘤之一，新發(fā)病例居我國所有惡性腫瘤的第4位；死亡病例居全部癌癥死亡病例第2位[1]。某些微小RNA(microRNA,miR)的表達異常可促進肝癌的發(fā)生。與編碼基因相同，miR啟動子區(qū)域CpG島甲基化異常，也可以引起miR表達缺失,影響腫瘤惡性表型的發(fā)展。本文初步探討了肝癌中CpG甲基化與miR-34沉默的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 肝癌病例組 收集2010年4月至2011年10月南通市腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)病理組織學(xué)確診的43例原發(fā)性肝癌手術(shù)病例以及臨近癌旁組織，無年齡、性別限制，患者的人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)包括性別、年齡、乙型肝炎病毒感染情況、丙型肝炎病毒感染情況、乙型肝炎肝硬化情況、具有完備的流行病學(xué)和臨床資料(如腫瘤的大小、單個或多發(fā)、有無包膜及有無門靜脈癌栓、臨床分期和Child分級等)、已經(jīng)隨訪和采集外周血生物樣本；手術(shù)前未接受過放療、生物治療或抗腫瘤藥物化療。該研究所需標本均經(jīng)過南通市倫理委員會同意通過。

1.1.2 資料和標本的收集 調(diào)查問卷主要包括一般情況、既往史、家族史、臨床診斷和治療情況等。為保證調(diào)查和隨訪資料的質(zhì)量，課題組統(tǒng)一制訂問卷調(diào)查和隨訪工作手冊，培訓(xùn)調(diào)查和隨訪人員，統(tǒng)一方法和標準。對所有資料由專人進行編碼，并在復(fù)核無誤后雙軌錄入計算機。對所有病例定期隨訪，每3個月一次直至死亡。

每個研究對象均采用真空抗凝采血管采集手術(shù)前靜脈血5 mL，4 h內(nèi)離心分別分離血漿、白細胞和紅細胞至1.5 mL離心管中(均各保存2份)，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，手術(shù)切除的組織標本離體10 min內(nèi)取材,經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的冷PBS沖洗后，液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 組織DNA和RNA的提取 分別采用QIAamp DNA mini kit、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit以及Trizol提取冰凍組織血液中DNA和RNA，其DNA和RNA濃度和純度均經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計檢測符合研究需要。

1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP) 基因組DNA(1 μg)嚴格按照EZ DNAMethylation-GoldTMKit甲基化試劑盒說明書操作。甲基化和非甲基化引物使用有關(guān)文獻報道過的[2-5]。陽性對照采用Qiagen甲基化和非甲基化人類DNA質(zhì)控品，陰性對照采用蒸餾水。miR-34a擴增程序為[4]：95 ℃ 5 min，95個循環(huán)； 2 ℃，20 s；68 ℃，30 s； 72 ℃，30 s； 66 ℃，2個循環(huán)和65 ℃，34個循環(huán)；最后72 ℃為4 min。miR-34b/c擴增程序為[4]，37 ℃，20 s，95個循環(huán)； 61 ℃，30 s和72 ℃，30 s,4 min。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)2.5%瓊脂糖凝膠和溴化乙錠染色。

1.2.3 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) miR-34a、miR-34b和miR-34c的表達使用定量RT-PCR進行檢測。總RNA(1 μg)使用miR特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和逆轉(zhuǎn)錄酶XL進莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄(RT)。cDNA在進行Real-time PCR前首先用水進行20倍稀釋，Real-time PCR 采用Power SYBR Green PCR Master Mix進行擴增。Real-time PCR是在ABI 7900 Real-Time PCR 系統(tǒng)里以一式三份的形式進行操作的。使用小核RNA U6進行了歸一化處理[6-7]。相關(guān)表達通過公式2-ΔCt計算，ΔCt=ctmirna-ctu6。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用EpiData對流行病學(xué)資料和實驗室數(shù)據(jù)進行錄入和管理，采用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行分析，分析方法包括計數(shù)資料的χ2檢驗、非參數(shù)檢驗，單因素和多因素Logistic回歸分析，COX回歸模型分析等，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者的臨床病理特征 43例肝癌患者中，男31例，女12例；中位年齡53歲；乙型肝炎病毒感染者28例，占65.1%；飲酒者13例，占30.2；吸煙者15例，占34.9%。見表1。

2.2 miR-34在肝癌組織和癌旁組織中的甲基化狀態(tài) miR-34a啟動子在43例肝癌組織中有31例(72.1%)發(fā)生了甲基化，高于癌旁組織22例(51.2%)(P=0.046)。79.1%(34/43)的肝癌組織和53.5%(23/43)的癌旁組織顯示miR-34b/c啟動子發(fā)生甲基化(P=0.012)。見圖1。

表1 肝癌患者miR-34甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR表達和miR甲基化之間的關(guān)系 為了進一步調(diào)查在肝癌中是否DNA甲基化沉默了miR-34家族的表達，我們評估了在甲基化和非甲基化組miR-34a、miR-34b和miR-34c表達水平，結(jié)果顯示，miR-34b表達水平在甲基化組明顯低于非甲基化組(P=0.026)。2組miR-34a和miR-34c沒有觀察到明顯變化。見圖2。

3 討論

miR作為一類重要的癌基因和抑癌基因，參與腫瘤維持生長信號、逃避生長抑制、抵抗凋亡、無限復(fù)制能力、引起血管生成、激活侵襲和轉(zhuǎn)移、調(diào)控能量代謝、逃避免疫摧毀等生物學(xué)行為[8]。以肝癌為例，miR-7可以通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制肝癌的生長[9]；miR-26a可以通過調(diào)控cMet信號通路抑制肝癌血管生成，影響肝癌患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸[10]。盡管miR可以靶向調(diào)控多個mRNA，發(fā)揮其重要生物學(xué)功能，但是miR異常表達的調(diào)控機制尚不明確。

DNA甲基化和組蛋白修飾也一直是基因表達調(diào)控方面的研究熱點[11]。已有研究[12]證據(jù)提示，miR異常表達可能受到DNA甲基化的影響。miR200b/miR200a/miR-429簇上游4個異常低甲基化的CpG位點可以在肝癌起始細胞和早期肝癌組織中上調(diào)miR-429的表達，進而通過一些信號通路促進肝細胞自我更新、惡性分化、化療抵抗以及致瘤等[13]。

圖1 肝癌組織和癌旁組織中miR-34a(A)和miR-34b/c(B)的MSP檢測結(jié)果

圖2 肝癌組織中miR-34b的甲基化狀態(tài)與表達的關(guān)系

miR-34家族是P53的轉(zhuǎn)錄目標，氣可以抑制肝癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。miR-34家族DNA甲基化改變已經(jīng)在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。在我們的研究中，我們首先探討了肝癌中miR-34家族CpG島甲基化，并且通過甲基化特異性PCR分析發(fā)現(xiàn)miR-34a和miR-34b/c甲基化的頻率分別為72.1%和79.1%。異常的DNA甲基化可抑制miR的表達，我們發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中miR-34家族的表達水平被下調(diào)，此結(jié)果提示我們在肝癌組織中miR-34家族具有抑制腫瘤的特性。此外，進一步的分析表明，對于本研究的肝癌患者，甲基化的腫瘤組織中miR-34b的表達水平明顯低于未甲基化組織，提示我們miR-34b啟動子區(qū)域CpG島異常甲基化可能沉默了其的表達。總之，肝癌組織中DNA甲基化可能參與了miR-34b的失活。

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Study on Methylation of MicroRNA-34 in the Hepatocellular Carcinoma

LIN Lan,LIU Jibin

(NantongTumourHospital，Nantong226361,China)

Objective To explore the value of methylation of microRNA-34 (miR-34) family in the hepatocellular carcinoma.Methods Tumor and adjacent non-tumor tissues were collected from 43 hepatocellular carcinoma patients who underwent surgery.Methylation specific PCR (MSP) method was used to analyze the methylation status of miR-34 in the hepatocellular carcinoma tissues and the adjacent non-tumor tissues,and the results were verified by reverse transcription PCR method.Results The methylation frequencies of miR-34a and miR-34b/c were 72.1% and 79.1% in the hepatocellular carcinoma tissues,which were significantly higher than that in the adjacent non-tumor tissues (P<0.05),respectively.The expressions of miR-34a and miR-34b/c were significantly down-regulated in the hepatocellular carcinoma tissues compared with adjacent non-tumor tissues (P<0.05).The expression of miR-34b were negatively related with DNA methylation in the hepatocellular carcinoma tissues.Conclusion DNA methylation may be involved in the inactivation of miR-34b in HCC.

microRNA-34；methylation；hepatocellular carcinoma

中國博士后科學(xué)基金資助項目(編號：2013M541563)；江蘇省六大人才高峰基金資助項目(編號：wsw-009)

林蘭(1968-)，女，副主任技師，主要從事腫瘤免疫學(xué)檢驗以及腫瘤預(yù)后研究工作。E-mail :kindrabbit75@163.com

劉繼斌(1974-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤生物治療相關(guān)研究。E-mail :tians2008@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.005

R735.7;R730.23

A

1673-5412(2017)01-0019-04

2016-12-20)