microRNA-183通過下調Bcl-2誘導人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡的研究

馬國祥 丁茜萍 鄧海華 楊振漢

廣東深圳市寶安區福永人民醫院內科 深圳 518103

microRNA-183通過下調Bcl-2誘導人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡的研究

馬國祥 丁茜萍 鄧海華 楊振漢

廣東深圳市寶安區福永人民醫院內科 深圳 518103

目的 研究microRNA-183對神經母細胞瘤細胞的調控作用，為神經母細胞瘤的治療提供新策略。方法 購買microRNA-183和對照 microRNA，轉染至人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞，再使用MTT實驗，Caspase-3活性測定試劑盒和流式檢測細胞生長和凋亡的影響。合成Bcl-2 siRNA，檢測Bcl-2對人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡的影響。轉染Bcl-2質粒后，再轉染microRNA-183至人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞，分析Bcl-2的表達水平和人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的凋亡。結果 轉染microRNA-183降低SK-N-SH細胞的生長(P=0.005 9)，發生磷脂酰絲氨酸膜表面表達(P=0.008)和Caspase-3的激活(P=0.014)，Bcl-2的表達降低(P=0.015)。干擾SK-N-SH細胞中Bcl-2增強了microRNA-183誘導的細胞凋亡(P=0.005 8)，而過表達Bcl-2抑制了microRNA-183誘導的細胞凋亡(P=0.007 3)。結論 轉染microRNA-183抑制SK-N-SH細胞的生長和增殖。microRNA-183通過下調Bcl-2而誘導SK-N-SH細胞的凋亡，提示Bcl-2可能是神經母細胞瘤潛在的候選治療靶點。

細胞凋亡；microRNA-183；Bcl-2；SK-N-SH細胞

神經母細胞瘤嚴重威脅著患者的生活和健康[1]。神經母細胞瘤的治療主要包括放化療、手術治療、分子靶向治療等[2]，針對不同的患者，上述治療方法療效均顯著，然而，也存在毒副作用強、適用人群少、分子靶點的選擇難等缺點[3-4]。microRNA調控細胞生長、凋亡和增殖作用[5]。在動物實驗中，microRNA常被作為癌癥治療的分子靶點[6]。然而，microRNA-183對神經母細胞瘤細胞生長和凋亡的調控作用尚不清楚。因此，本研究以人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞為細胞模型，探討microRNA-183對人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞可能的調控機制，以期為神經母細胞瘤分子靶點的治療提供理論依據。

1 實驗試劑和方法

1．1 實驗試劑和實驗細胞 小鼠源抗人Bcl-2的多克隆抗體，HRP標記的羊源抗小鼠的IgG單克隆抗體，內參抗actin內參的多克隆抗體來源于美國Santa Cruz生物技術有限公司。細胞培養用血清和培養基來源于華蘭生物用品公司。MTT試劑盒來源于碧云天生物技術研究所。細胞凋亡試劑來源于北京鼎國科技有限責任公司公司。

microRNA如microRNA-83(5′-ACATCACA-TCGGTAGTTGCCAT-3′和5′- AAACAAAGAGGTAAAGGTGCA-3′)，對照microRNA(5′-CCAACGAGTGTCTTTCGAGC-3′和5′-TTGACGTTT-CACGATACAT-3′)和siRNA Bcl-2(5′-CTACGTGCTACCATGGATGC-3′和5′-TTCTAGAACTACGCTATGT-3′)，Bcl-2的質粒來源于上海生物工程有限公司。Lipo2000轉染試劑來源于美國Invitrogen。

1．2 細胞培養的方法 復蘇人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞，將人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞重懸于DMEM培養基中，37 ℃，5% CO2[7]。

1．3 轉染方法 將microRNA-183和對照micro-RNA轉染至人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞。將人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞鋪板于24孔板，密度30%左右，將microRNA-183和對照microRNA加入lipo2000中，混勻，室溫放置7 min，將混合液加入細胞中，37 ℃，5% CO2[8-9]。

1．4 MTT試劑盒檢測細胞活性 按照MTT試劑盒的說明檢測人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的活性[10]。首先，接種人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞。按1.3的描述向人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞轉染microRNA-183或對照miRNA后，再加入1 mg/mL MTT反應液，培養人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞24 h。最后在細胞里加入終止反應液DMSO，終止反應。

將6孔板人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞放入酶標儀中，測試人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞在560 nm處的吸收值，繪制人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞生長曲線[11]。

1．5 流式細胞術檢測細胞凋亡 人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的凋亡情況使用流式檢測。首先，接種人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞。按1.3的描述向人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞轉染microRNA-183或對照miRNA后，向200 μL體積的細胞中加入16 μL的反應液和2 μL的染料Annexin-V-FITC，避光反應14 min。最后上流式檢測[12]。1．6 聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot免疫印跡 首先，接種人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞。按1.3的描述向人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞轉染microRNA-183或對照miRNA后，收集細胞，向細胞中加入細胞裂解液裂解，制備聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品，進行電泳，電泳結束轉膜、封閉，孵育一抗、二抗，最后進行顯影、定影[13]。

1．7 Caspase-3活性測試 按照試劑盒的說明檢測人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的凋亡情況。首先，接種人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞。按1.3的描述向人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞轉染microRNA-183或對照miRNA后，裂解細胞，向細胞樣品中加入生色底物反應。最后在酶標儀上測試各組樣品的光吸收值[14]，作為細胞Caspase-3活性的相對值。

2 結果

2．1 轉染microRNA-183降低了人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的活性 各實驗組的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞活性通過MTT測試，與轉染對照miRNA的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞相比，轉染microRNA-183后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的生長被顯著抑制(P=0.005 9)。見圖1。

由于轉染對照miRNA的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞和未轉染組人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的活性差異無統計學意義(P>0.05)，所以，以轉染miRNA細胞組作為對照。

圖1 轉染microRNA-183降低了人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的活性，抑制其生長 與miRNA組相比，**P<0.01 圖2 轉染microRNA-183引起人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的凋亡與miRNA組相比，**P<0.01

2．2 轉染microRNA-183引起人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的凋亡 如圖2所示，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞磷脂酰絲氨酸的外翻，與轉染對照miRNA的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞相比，轉染microRNA-183后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻的量顯著增加(P=0.008)。

2．3 轉染microRNA-183引起人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞中Caspase-3的活化 圖3中人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞中細胞凋亡的檢測數據提示，與轉染miRNA的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞相比，轉染microRNA-183后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡增加(P=0.014)。

圖3 轉染microRNA-183引起人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的Caspase-3的活化 與miRNA組相比，*P<0.05 圖4 轉染microRNA-183引起人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞中Bcl-2蛋白表達的下降

2．4 轉染microRNA-183引起人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞中Bcl-2蛋白表達的下降 如圖4所示，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞中細胞凋亡的檢測數據提示，與轉染對照miRNA的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞相比，轉染microRNA-183后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞細胞凋亡增強(P=0.015)。

2．5 敲低Bcl-2增強microRNA-183引起的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡 如圖5所示，降低Bcl-2的表達后，再轉染microRNA-183后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡增加(P=0.007 6)。microRNA-183組和siBcl-2+microRNA-183細胞凋亡差異有統計學意義(P=0.005 8)。

圖5 敲低Bcl-2增強microRNA-183引起的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡 與miRNA組相比，*P<0.05；microRNA-183組和siBcl-2+microRNA-183細胞凋亡比較，#P<0.05

2．6 轉染Bcl-2抑制了microRNA-183誘導的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡 圖6中Western blot結果表明，Bcl-2的質粒轉染增加了其水平。microRNA-183組和Bcl-2+microRNA-183組間Bcl-2比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖6示，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞中細胞凋亡的檢測結果表明，轉染Bcl-2增強Bcl-2水平后，再轉染microRNA-183后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡被明顯抑制(P=0.006)。microRNA-183組和Bcl-2+microRNA-183細胞凋亡差異有統計學意義(P=0.007 3)。

圖6 轉染Bcl-2抑制了microRNA-183誘導的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡與miRNA組相比，*P<0.05；microRNA-183組和Bcl-2+microRNA-183比較，#P<0.05

3 討論

本研究以人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞為細胞模型，從蛋白水平上研究了microRNA-183對人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的調節機制，結果顯示，轉染microRNA-183降低了人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的生長，引起人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡。這與前人研究結果高度一致，即microRNA調控細胞生長和細胞凋亡[15]。

Bcl-2蛋白是Bcl-2蛋白家族中重要的細胞凋亡抑制蛋白之一[7-8]。據研究報道，Bcl-2可能受microRNA-183的調節，進而調節人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞[9-10]。本研究結果證明，轉染microRNA-183降低了Bcl-2的蛋白水平。轉染microRNA-183和降低Bcl-2的表達后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的凋亡增加，而轉染Bcl-2則抑制了microRNA-183誘導的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡。

本文采用不同的方法證明了Bcl-2蛋白在microRNA-183誘導的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡中的作用：(1)Western blot結果顯示，microRNA-183高表達時，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞中的Bcl-2蛋白顯著降低；(2)轉染Bcl-2 siRNA后，再轉染microRNA-183至人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞后，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡增強；(3)轉染Bcl-2質粒后，再轉染microRNA-183至人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞，人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡被顯著抑制。結果表明，Bcl-2蛋白在microRNA-183誘導的人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞凋亡中發揮關鍵作用，Bcl-2蛋白是潛在的神經母細胞瘤的分子靶點[11-12]。Bcl-2可抑制癌細胞的細胞凋亡[13-14]，這是一致性的結論。

本文的不足和缺點如下：(1)缺少臨床神經母細胞瘤的樣本和對照組織中Bcl-2蛋白水平的結果；(2)缺少預后臨床神經母細胞瘤的樣本和對照組織中Bcl-2蛋白水平的結果；(3)缺少神經母細胞瘤的小鼠模型和以microRNA-183為靶點治療的神經母細胞瘤小鼠的療效結果。

轉染microRNA-183抑制人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的生長和增殖，microRNA-183通過下調Bcl-2而誘導人神經母細胞瘤細胞株SK-N-SH細胞的凋亡，提示Bcl-2可能是神經母細胞瘤潛在的候選治療靶點。

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(收稿2016-10-20)

microRNA-183 induces apoptosis of human neuroblastoma cell line SK-N-SH by down regulating Bcl-2 disease rats

MaGuoxiang，DingQianping，DengHaihua，YangZhenhan

FuyongPeople'sHospitalofShenzhenBaoanDistrict，Shenzhen518103，China

Objective To study the regulation of microRNA-183 on neuroblastoma cells and to provide a new strategy for the treatment of neuroblastoma．Methods microRNA and microRNA-183 were transfected into SK-N-SH cells，and then MTT experiment and Caspase-3 activity assay and flow cytometry were employed to investigate the role of microRNA-183 in growth and apoptosis of human neuroblastoma cell line SK-N-SH．Bcl-2 siRNA was transfected into SK-N-SH cells，and effects of Bcl-2 on human neuroblastoma cell line SK-N-SH cells apoptosis was tested．After transfection of Bcl-2 plasmid，microRNA-183 was transfected into human neuroblastoma cell line SK-N-SH cells，and the expression level of Bcl-2 and apoptosis of human neuroblastoma cell line SK-N-SH were analyzed．Results The transfection of microRNA-183 reduced cell growth of the SK-N-SH cells (P=0.005 9)，and the expression of phosphatidylserine on the membrane (P=0.008) and activation of Caspase-3 were observed (P=0.014)，and the expression of Bcl-2 was decreased (P=0.015)．Bcl-2 interference of human neuroblastoma cell lines enhances apoptosis of the human neuroblastoma cell line SK-N-SH induced by microRNA-183 (P=0.005 8)，and overexpression of Bcl-2 inhibits apoptosis induced by microRNA-183 (P=0.007 3)．Conclusion The transfection of microRNA-183 inhibits the growth and proliferation of human neuroblastoma cell line SK-N-SH．MicroRNA-183 induces apoptosis of SK-N-SH by down regulating Bcl-2，which suggests that Bcl-2 may be a potential candidate therapeutic target for neuroblastoma．

Apoptosis；microRNA-183；Bcl-2；SK-N-SH cell

R730.264

A

1673-5110(2017)07-0003-04