大鼠結腸平滑肌細胞分離及電生理功能鑒定

邱素華

消化道的運動依賴消化道平滑肌的收縮, Ca2+是觸發平滑肌肌絲滑行的關鍵因素, 細胞內Ca2+在興奮收縮耦聯中起重要作用, Ca2+濃度改變會導致一系列病理生理過程［1-5］。膜片鉗技術可觀察結腸平滑肌細胞膜Ca2+電流特征, 為研究及治療相關疾病提供新的思路［6-10］。膜片鉗技術需要高產量和高質量的細胞, 傳統的機械分離法對平滑肌細胞的損傷較大, 細胞存活率低, 存活時間短, 難以滿足電生理實驗需求,因此建立分離結腸平滑肌細胞的方法成為必然。本研究通過查閱國內外現行的平滑肌細胞的分離方法并加以改進［11-15］,建立了適合電生理研究的結腸平滑肌細胞分離方法, 該方法操作簡便, 重現性好。

1 材料與方法

1.1 試劑及溶液 試劑: 膠原酶Ⅱ、大豆胰蛋白酶抑制劑、HEPES及EGTA購于Sigma 公司, 其他試劑均為市售產品。無鈣臺氏液(mmol/L): 氯化鈉(NaCl)137, 氯化鉀(KCl)5.4, 六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O)1, 磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.33, 葡萄糖10, 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)10, 氫氧化鈉(NaOH) 調pH至7.40。消化液：含0.1%膠元酶Ⅱ和0.01%大豆胰蛋白酶抑制劑的無鈣臺氏液。KB液(mmol/L) : KCl 40, KH2PO420, MgCl2·6H2O 3, L-谷氨酸 50, 牛磺酸 20, HEPES 10, 氫氧化鉀(KOH) 80, 葡萄糖10, 乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)0.5, KOH調pH至7.40。Ca2+電極內液(mmol/L):氯化銫(CsCl)120, 二水氯化鈣 (CaCl2·2H2O)1, MgCl2·6H2O 5, 5 5-三磷酸腺苷二鈉(ATP-Na2), EGTA 11, HEPES 10, 葡萄糖11,KOH調pH至7.20。Ca2+細胞外液(mmol/L): NaCl 120, CsCl 5, CaCl2·2H2O 1, MgCl2·6H2O 1, 氯化四乙胺 (TEA-Cl)20,Glucose 5.5, HEPES 10, NaOH調pH至7.35。溶液使用前均需氧飽和。

1.2 方法

1.2.1 單個結腸平滑肌細胞的分離 參照Bitar法加以改進, Wistar大鼠, 180～220 g, 雌雄不限, 實驗前禁食24 h, 自由飲水。頸椎脫臼處死, 剖開腹腔, 快速自肛門上2 cm取結腸約10 cm, 并放置在4℃無鈣臺氏液中, 沖洗結腸內殘余糞便。將沖洗干凈的腸段移入含無鈣臺氏液的塑料培養板中,體視顯微鏡下采用機械法小心的刮除黏膜層、黏膜下層及漿膜層, 將較純的平滑肌組織層剪成1～2 mm3的碎塊, 加入到消化液中, 37℃恒溫水浴震蕩20 min, 200 g/min 離心5 min,棄消化液。再加入10 ml消化液, 37℃恒溫水浴震蕩20 min,加2倍無鈣臺氏液中止消化, 用玻璃吸管柔和吹打3 min, 使細胞自由脫落, 尼龍網過篩(孔徑500 μm), 離心, 棄上清, 加適量KB液懸浮細胞, 4℃冰箱儲存待用, 電生理實驗一般在8 h內使用。

1.2.2 細胞形態觀察 單個結腸平滑肌細胞在KB 液中保存1 h后, 離心, 采用梯度復鈣法, 使細胞外Ca2+終濃度恢復至1 mmol/L后, 取一滴細胞懸液置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.3 細胞活性檢測 0.4%臺盼藍溶液與細胞懸液1∶1混合, 室溫放置3～5 min, 取20 μl細胞懸液置于血細胞計數板上, 高倍鏡下觀察細胞存活狀況。死細胞染成淡藍色, 而活細胞不染色并保持正常形態。

1.2.4 細胞鈣電流記錄 細胞池中預先沖入鈣電流細胞外液, 取已復鈣的細胞懸液加入細胞池中, 靜止10 min使細胞貼壁。將充灌電極內液的玻璃微電極與細胞膜接觸, 給予輕微負壓開始封接, 當封接電阻大于1 GΩ后即形成高阻封接,破膜, 形成全細胞模式, 采用Axopatch 200B 放大器(AXON公司)記錄細胞膜鈣電流。電極尖端電阻以 2～6 MΩ為宜。

1.2.5 鈣電流數據采用Clampfit10軟件進行分析, 并通過Sigmaplot軟件進行作圖及曲線擬合。

2 結果

2.1 單個結腸平滑肌細胞的分離及質量測定 光鏡下觀察,細胞呈梭形, 橫紋清晰, 遮光性較強, 長度各異, 有的舒張,有的收縮, 細胞成活率90%左右(圖1a), 細胞外Ca2+濃度恢復至1 mmol/L后, 細胞仍能保持長梭形, 細胞邊緣清晰, 有光澤(圖1b)。經臺盼藍染色, 80% 以上的長梭狀平滑肌細胞不染色并保持正常形態, 提示細胞成活率達80%。

圖1 a 分離的大鼠結腸平滑肌細胞

圖1 b 復鈣后的大鼠結腸平滑肌細胞

2.2 細胞鈣電流記錄

2.2.1 -80 mV鉗制電壓鉗制細胞, 給予10 ms的快速刺激,使快鈉通道失活, 再給予-40 mV的鉗制電壓, 從-40 mV開始, 以10 mV的階躍刺激連續去極化至+50 mV, 持續500 ms,刺激頻率0.5 Hz, 記錄細胞鈣穩態激活電流(圖2a)。

2.2.2 ICa-L電流-電壓(I-V)曲線：大鼠結腸平滑肌細胞最大激活電壓為-10 mV, 反轉電位為33 mV(圖2b)

2.2.3 采用雙脈沖刺激, 保持電壓-80 mV, 先給予條件脈沖從-90 mV, 每隔10 mV連續去極化至0 mV, 持續300 ms, 然后至-40 mV, 間期1 ms, 再跟一固定的去極化至0 mV, 持續140 ms的測試脈沖。記錄細胞鈣穩態失活曲線(圖2c)。

2.2.4 采用雙脈沖刺激, 保持電壓-40 mV, 先給予去極化至0 mV, 持續260 ms的條件脈沖, 再給一同樣的刺激脈沖, 兩脈沖的間隔時間從0～1 s逐漸增加, 每次75 ms。記錄細胞鈣穩態失活曲線(圖2d)。

圖2 a 大鼠結腸平滑肌細胞L-型鈣穩態激活電流

圖2 c 大鼠結腸平滑肌細胞L-型鈣穩態失活曲線

圖2 b ICa-L電 流-電壓(I-V)曲線

圖2 d 大鼠結腸平滑肌細胞L-型鈣穩態失活后恢復曲線

3 討論

Ca2+是細胞內重要的第二信使, 幾乎存在于所有的可興奮細胞中, 它參與調節機體多種生命活動過程, 如：神經傳導、肌肉收縮等［16-20］。Ca2+在平滑肌的收縮反應中起核心作用, 胞漿內Ca2+濃度的變化是啟動平滑肌興奮-收縮耦聯的核心, 因此觀察結腸平滑肌細胞膜鈣電流的變化, 將為治療相關疾病的研究提供新的思路［21-25］。本研究在成功分離大鼠結腸平滑肌細胞的基礎上, 采用全細胞膜片鉗技術記錄細胞膜鈣電流并觀察了其激活、失活及失活后恢復曲線, 記錄的鈣電流電生理特征表明該方法得到的結腸平滑肌細胞具有完整的電生理活性。

新鮮分離的大鼠結腸平滑肌細胞更接近機體的自然狀態, 且能排除機體體液及神經因素對實驗的影響, 本實驗從細胞形態、細胞活性和電生理功能特性三個方面, 鑒定了新鮮分離的大鼠結腸平滑肌細胞質量, 該方法操作簡便, 重現性好。

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