辛伐他汀對白癜風氧化應激模型中角質(zhì)形成細胞趨化因子分泌的影響

辛伐他汀對白癜風氧化應激模型中角質(zhì)形成細胞趨化因子分泌的影響

常毓倩 李舒麗 堅 哲 安亞文 高天文 李春英

目的:明確辛伐他汀對氧化應激下人原代角質(zhì)形成細胞(KC)分泌趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22的影響。方法:常規(guī)培養(yǎng)KC，H2O2組給予1 mM H2O2模擬白癜風KC氧化應激模型，實驗組予不同濃度辛伐他汀(0．1μmol/L、0．5μmol/L、1．0μmol/L)預處理后加入H2O2;采用Real－time PCR、ELISA及Western blot檢測CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22的mRNA表達及蛋白分泌。結(jié)果:辛伐他汀組CXCL9、CXCL10、CXCL11水平低于H2O2組，CCL22水平高于且呈H2O2組，呈劑量依賴方式。結(jié)論:辛伐他汀能通過應激的角質(zhì)形成細胞調(diào)控分泌Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22的水平。

辛伐他汀;原代角質(zhì)形成細胞;氧化應激;趨化因子

白癜風是一種常見的自身免疫性皮膚病，氧化應激被公認為是發(fā)病的重要原因之一，而T細胞介導的自身免疫是黑素細胞破壞的關(guān)鍵效應環(huán)節(jié)。研究表明［1］，白癜風皮損Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11顯著升高，介導白癜風CD8+T細胞向皮膚遷移，而CCL22顯著降低，抑制Treg細胞向皮膚浸潤，最終導致黑素細胞免疫損傷［2，3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可顯著降低CD8+T細胞在白癜風小鼠皮損處局部的浸潤，促進白癜風復色，但具體機制不清［4］。辛伐他汀是甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑，也是臨床上廣泛使用的降脂類藥物。近年來，大量研究證實其藥物的多效性，即“非降脂作用”，具體表現(xiàn)在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等方面［5］。值得注意的是，辛伐他汀的免疫調(diào)節(jié)作用被證實可治療多種自身免疫性疾病，并在多發(fā)性硬化中取得臨床證據(jù)［6，7］。早在2004年，No l等報道一位白癜風合并高膽固醇血癥的患者，每日80mg大劑量口服辛伐他汀時顯著促進了其白癜風皮損復色［8］，首次證實辛伐他汀可以治療白癜風。本研究擬證明在氧化應激條件下，白癜風發(fā)病重要趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22的表達變化，進一步探討辛伐他汀對這些趨化因子表達的影響。

1 材料與方法

1．1 主要儀器與試劑原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基KSFM購自美國Gibco公司。辛伐他汀(分子式:C25H39NaO6，貨號D00175272)購自Calbiochem公司。細胞總RNA提取試劑盒購自日本Takara公司。RIPA裂解液及BCA蛋白定量試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。ELISA檢測試劑盒購自美國RD公司。兔抗人CXCL9、CXCL10、CXCL11和CCL22抗體均購自美國Abcam公司，鼠抗人β－actin單克隆抗體購自Sigma公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購自康為世紀生物科技公司。

1．2．1 原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)及處理正常包皮組織均來源于第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院泌尿外科2015年度2～4月，2～18歲男性，取泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后皮損，約3．0cm直徑大小，用添加雙抗的DMEM培養(yǎng)基反復漂洗。剪除脂肪組織和結(jié)締組織，避免破壞表皮，將皮損剪至條狀，約1．0cm×0．5cm大，反復漂洗后移入Dispase液中，4℃過夜消化17 h。輕輕剝離皮膚表皮層，剪碎，無菌濾網(wǎng)過濾，收集過濾細胞懸液，加入含有0．25%胰酶的DMEM培養(yǎng)基，37℃消化10min，確保表皮層90%角質(zhì)形成細胞分離后終止消化。1000rpm離心10min，收集細胞，置于限制性角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基(KSFM)調(diào)定細胞密度(1～2)×106接種，37℃、5%CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)。光學顯微鏡下持續(xù)觀察細胞，選擇培養(yǎng)到第三代至第五代的原代角質(zhì)形成細胞，進行常規(guī)伊紅和蘇木精染色，鑒定其純度達95%，方可用于后續(xù)實驗。常規(guī)培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)待細胞生長至70%～80%融合時，實驗組予以濃度梯度的辛伐他汀預處理24 h，之后再予以1mM H2O2處理24 h。對照組予DMSO處理，培養(yǎng)后收集細胞裂解液及上清檢測CXCL9，CXCL10，CXCL11及CCL22的分泌及蛋白、mRNA的表達水平。

1．2．2 Real－time PCR檢測趨化因子的表達Trizol試劑提取細胞RNA，按照試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行qRT－PCR檢測。引物設計及合成由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成，人CXCL9上游引物:5＇－TCTAAACCCAGATTCAGCA－3＇，下游引物:5＇－CTCCTTTGGAATGATAGCG－3＇;人CXCL10上游引物:5＇－CTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGA－3＇，下游引物:5＇－CAATGATCTCAACACGTGGACAA－3＇;人CXCL11上游引物:5＇－GGGTACATTATGGAGGCTTTCTCA－3＇，下游引物:5＇－GAGGACGCTGTCTTTGCATAGG－3＇，人CCL22上游引物:5＇－ATCGCCTACAGACTGCACTC－3＇，下游引物:5＇－GACGGTAACGGACGTAATCAC－3＇;人β－actin上游引物:5＇－CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC－3＇，下游引物:5＇－TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT－3＇。

1．2．3 ELISA檢測趨化因子的表達收集實驗組及對照組細胞上清，按照ELISA檢測試劑盒操作說明檢測CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22分泌水平。

1．2．4 Western blot印跡檢測趨化因子蛋白表達的水平收集實驗處理組及對照組原代角質(zhì)形成細胞，以RIPA裂解液裂解并提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法定蛋白含量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)。PVDF膜經(jīng)甲醇激活后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(直流電300mA)。轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1～4 h，加入一抗(兔抗人CCL22單克隆抗體1:1000;兔抗人CXCL9多克隆抗體1:1500;兔抗人CXCL10多克隆抗體1:500;兔抗人CXCL11多克隆抗體1∶500;鼠抗人β－actin 1∶5000，均購自美國Sigma公司)4℃過夜，次日予以辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (1∶5000)、山羊抗小鼠IgG(1∶5000)二抗室溫孵育1 h，使用化學發(fā)光儀檢測結(jié)果。

1．2．5 統(tǒng)計學方法用Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件進行分析，采用student t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 辛伐他汀對氧化應激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22 mRNA表達的影響在1 mM H2O2模擬白癜風KC氧化應激模型，Real Time－PCR檢測發(fā)現(xiàn)CXCL9、CXCL10及CXCL11的mRNA水平均明顯上調(diào)(圖1a，c)，而CCL22的mRNA表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(圖1d)。當用不同濃度辛伐他汀預處理KC 24 h，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可呈劑量依賴趨勢抑制H2O2誘導的CXCL9、CXCL10及CXCL11的mRNA表達，其中對CXCL10的影響最為顯著(圖1a，b)，并且可以呈濃度依賴的趨勢增強CCL22的mRNA表達(圖1d)。

2．2 辛伐他汀對氧化應激下KC分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22的影響通過ELISA實驗發(fā)現(xiàn)，同Real time－PCR結(jié)果一致，氧化應激條件下KC分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11的能力增強，且CXCL10明顯呈時間依賴趨勢(圖2a，b，c)，CCL22分泌降低(圖2d)。同樣，當用不同濃度辛伐他汀預處理后，可以呈濃度依賴的趨勢抑制H2O2誘導的CXCL9、CXCL10及CXCL11分泌(圖2a，b，c)，上調(diào)CCL22的水平(圖2d)。

2．3 伐他汀對氧化應激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22蛋白水平表達的影響選取最佳辛伐他汀藥物濃度1．0μmol/L，預處理KC，再經(jīng)1．0 mmol/L H2O2刺激后，檢測KC中不同趨化因子蛋白表達情況。Western印記結(jié)果顯示辛伐他汀可顯著下調(diào)細胞內(nèi)氧化應激誘導的CXCL9、CXCL10及CXCL11蛋白表達，上調(diào)CCL22的表達(圖3)。

圖1 a，b，c，d辛伐他汀對氧化應激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22 mRNA表達的影響(n=3，*P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001)

圖2 a，b，c，d辛伐他汀對氧化應激下KC分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22的影響(n=3，#與DMSO組比較，#P＜0．05，## P＜0．01，###P＜0．001;*與DMSO+H2O2處理組比較，*P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001)

圖3 辛伐他汀對氧化應激下KC中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL22蛋白水平表達的影響

3 討論

研究表明，白癜風是在特定遺傳背景下，氧化應激與自身免疫共同作用于黑素細胞導致表皮色素脫失的疾病，其中氧化應激引起免疫失調(diào)是白癜風發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9－11］。最近有研究表明Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11在白癜風皮損處高表達，通過與受體CXCR3結(jié)合促進IFN－γ活性效應CD8+細胞定向皮膚遷移。此外有研究發(fā)現(xiàn)，白癜風患者皮損中介導Treg細胞皮膚遷移的趨化因子CCL22表達下調(diào)，并認為其造成Treg細胞數(shù)量減少，不能有效抑制CD8+T細胞對黑素細胞的殺傷效應，促進白癜風進展［2，12］。并且體內(nèi)研究表明，通過上調(diào)CCL22表達，促進Treg細胞的皮膚浸潤，或是采用中和抗體抑制Th1型趨化因子CXCL10表達，減少CD8+T細胞的皮膚聚集，均可抑制白癜風進展，促進復色［13－15］。該系列研究表明這些趨化因子的異常表達是白癜風致病的關(guān)鍵。我們的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激條件下，角質(zhì)形成細胞可促進致病性Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11分泌增多，而對CCL22的表達及分泌具有顯著抑制作用，提示白癜風角質(zhì)形成細胞在調(diào)控致病性趨化因子表達方面起重要作用。

最近有研究報道，辛伐他汀通過作用于IFN－r－STAT1通路可顯著抑制鼻病毒感染引起的單核細胞中CXCL10的表達，因此被多位學者指出可作為鼻病毒導致相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病的治療［4］。值得注意的是，John E Harris領導的研究小組在白癜風小鼠模型中，予以高劑量的辛伐他汀治療亦可產(chǎn)生同拮抗CXCL10、CXCR3一致的效果，即減少CD8+T細胞的皮膚浸潤，促進白癜風白斑復色［16］。然而辛伐他汀是否可以在原代細胞水平影響白癜風中角質(zhì)形成細胞趨化因子的表達目前尚沒有研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以劑量依賴的方式，抑制氧化應激下角質(zhì)形成細胞分泌Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11，并且對CXCL10的影響最為顯著，且能恢復氧化應激導致的CCL22分泌障礙，顯著上調(diào)CCL22表達水平。該結(jié)果為辛伐他汀可用于白癜風治療提供了新的理論依據(jù)，辛伐他汀調(diào)控這些趨化因子表達的具體機制，有待進一步研究。

綜上所述，本研究明確辛伐他汀通過調(diào)控應激的角質(zhì)形成細胞分泌Th1型趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11，以及CCL22的水平，促進白癜風局部免疫穩(wěn)態(tài)平衡，起到治療白癜風的作用。

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(收稿:2016－09－07修回:2016－10－26)

Effects of simvastatin on the expression of chemokine in the keratinocyte under oxidative stress

CHANGYuqian，LIShuli，JIANZhe，ANYawen，GAOTianwen，LIChunying．
DepartmentofDermatology，XijingHospital，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity，Xi＇an710032，China Correspondingauthor:LIChunying，E－mail:lichying@fmmu．edu．cn

Objective:To determine the effect of simvastatin on the expression of CXCL9，CXCL10，CXCL11 and CCL22 in H2O2－treated primary human keratinocytes(KC)．Methods:KC in the experimental group was pre－treated with different concentration of simvastatin(0．1μmol/L，0．5μmol/L and 1．0μmol/ L)，and then，exposed to 1．0 mM H2O2for 24 h．KC in the H2O2group was treated with 1．0 mM H2O2only．The expression levels of mRNA and protein of CXCL9，CXCL10，CXCL11 and CCL22 were detected by Real－time PCR，Western blot and ELISA．Results:The expression levels of mRNA and protein of CXCL9，CXCL10 and CXCL11 in the experimental group were higher than those in H2O2group，and the level of CCL22 was lower than that in H2O2group．Conclusion:Simvastatin can influence the levels of CXCL9，CXCL10，CXCL11 and CCL22 through regulating oxidatively stressed KC．

simvastatin;keratinocytes;oxidative stress;chemokine

國家自然科學基金資助項目(編號:XJZT15M10，81402599)作者單位:第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院，西安，710032

李春英，E－mail:lichying@fmmu．edu．cn