直鏈烷基苯磺酸鈉對小鼠皮膚組織老化的促進作用

趙文紅 張 雯 王金花 王開磊

(蚌埠醫學院預防醫學系，安徽 蚌埠 233030)

直鏈烷基苯磺酸鈉對小鼠皮膚組織老化的促進作用

趙文紅 張 雯 王金花 王開磊

(蚌埠醫學院預防醫學系，安徽 蚌埠 233030)

目的 探討直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)對小鼠皮膚組織衰老的影響。方法 將50只健康昆明種雄性小鼠，隨機分成5組，每組10只。各組分別為正常對照組、LAS低、中、高劑量組(LAS 150、300、600 mg/L)及D-半乳糖衰老模型組。正常對照組及LAS各劑量組分別用蒸餾水及不同劑量的LAS涂抹小鼠的背部剃毛處，連續涂抹60 d，衰老模型組小鼠每日在頸背部皮下注射5%D-半乳糖，連續注射60 d。取涂抹部位皮膚進行Masson及β-半乳糖苷酶染色；檢測皮膚勻漿中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性；測定皮膚組織中羥脯氨酸(Hyp)含量。結果 與正常對照組相比，LAS各劑量組及衰老模型組小鼠皮膚組織變薄，膠原纖維減少，纖維排列雜亂、松散、模糊；β-半乳糖苷酶表達程度明顯增高；MDA含量明顯增加(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性及Hyp含量均明顯降低(P<0.01)。結論 LAS可促進小鼠皮膚組織的老化。

直鏈烷基苯磺酸鈉；皮膚組織；老化

直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)是目前最普遍使用的陰離子型表面活性劑，是家用洗滌用品中的主要去污成分〔1〕。LAS對人屬低毒類物質，難以降解，但在生產與生活過程中長期接觸可使機體產生復雜的綜合性的不良反應，尤其是容易殘留于水中，或在生產或生活過程中易于與人的皮膚接觸。有報道〔2〕從事家務勞動的婦女頻繁接觸各類洗滌劑引起手部皮炎的發病率逐年上升，洗滌劑被稱為危害女性健康的潛在“殺手”。有關洗滌劑對機體皮膚損傷的機制還不清楚，本研究以小鼠作為實驗對象，觀察小鼠皮膚連續涂抹不同劑量的LAS后，皮膚中與衰老有關的生化指標及組織病理學變化，并利用前人〔3〕的經驗，對小鼠連續皮下注射D-半乳糖，建立小鼠亞急性皮膚衰老模型，與LAS涂抹組小鼠進行比較、分析，為探討LAS對皮膚損傷、衰老的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 LAS、甲醛、二甲苯、石蠟，國產試劑均為分析純，購自蚌埠醫學院試劑公司；D-半乳糖(分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、Masson染液及考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產品；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒由碧云天生物技術研究所提供。722 s型分光光度計；FA2004電子天平；DY89-I型電動玻璃勻漿機；超低溫離心機(德國Eppendorf 公司)；YL3回轉式切片機(上海儀表廠)；Synergy 2 型酶標儀(美國Biotek公司)；全自動高壓滅菌器(日本三菱集團)。

1.2 實驗動物 5～6周齡昆明種雄性小鼠50只，體重(24±1.0)g。購自安徽省實驗動物中心，清潔級動物，動物批號：scxk(皖)2011-002。動物飼養溫度(22±2)℃，相對濕度 65%，自由飲水進食。

1.3 實驗方法

1.3.1 LAS及D-半乳糖劑量的確定 LAS劑量參考預實驗結果及本實驗室以往的實驗資料〔4,5〕。參考相關資料〔6〕，利用D-半乳糖制備亞急性衰老小鼠模型，每日在小鼠頸背部皮下注射5%D-半乳糖25 ml/kg，持續60 d。

1.3.2 小鼠分組及處理 將50只雄性小鼠常規飼養1 w后隨機分成5個組，每組10只，分別為正常對照組、LAS低、中、高劑量組(LAS 150、300、600 mg/L)及衰老模型組。正常對照組及LAS不同劑量組的處理：在每個小鼠的背部剃毛，面積約1.5 cm×1.5 cm，每天用蒸餾水及不同劑量的LAS涂抹剃毛處，連續涂抹60 d。在其過程中，小鼠毛發生出，及時剃除。衰老模型組小鼠每日在頸背部皮下注射5%D-半乳糖25 ml/kg，持續60 d。 各組小鼠每周稱重1次，第61天將小鼠脫臼致死，取涂抹部位皮膚(衰老模型組小鼠背部剃毛并摘取相應部位皮膚)，去除皮下脂肪組織，用4℃生理鹽水清洗，濾紙拭干，一部分固定用于組織切片，一部分用于皮膚勻漿，另外一部分用于測定羥脯氨酸(Hyp)含量。

1.3.3 皮膚組織切片Masson染色 按試劑盒說明，將皮膚組織石蠟切片經脫蠟、梯度入水及溫熱水漂洗后分別用核染液、漿染液、分色液及復染液染色、沖洗、封片后，置鏡下觀察。

1.3.4 皮膚組織衰老的β-半乳糖苷酶染色 按試劑盒說明，將皮膚組織石蠟切片經脫蠟及水化處理，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定20 min，用PBS液洗滌，加入染色工作液，37℃溫箱孵育過夜，普通顯微鏡下觀察。

1.3.5 皮膚組織勻漿制備及指標檢測 取部分皮膚組織用剪刀剪碎，按1 g加9 ml生理鹽水制成10%的勻漿，3 000 r/min將勻漿液離心10 min，取上清液。按試劑盒要求，檢測小鼠皮膚組織勻漿中 MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.3.6 皮膚組織中Hyp檢測 按試劑盒要求，準確稱取小鼠皮膚組織80～100 g，剪碎，加6 mol/L HCl 1 ml,沸水浴水解5 h。水解液調pH值6.0～6.8，加雙蒸水至10 ml，取4 ml稀釋液用活性炭澄清混勻，離心后取1 ml作為檢測用。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1 皮膚組織切片Masson染色結果 LAS中、高劑量組小鼠與正常對照組小鼠相比較，其表皮及真皮厚度明顯變薄。正常對照組小鼠皮膚中膠原纖維致密、均勻排列，LAS高劑量組和衰老模型組小鼠，膠原纖維量染色呈淺藍色，皮膚淺表部位，膠原纖維排列雜亂、松散、模糊，失去束狀排列，膠原纖維量明顯減少，見圖1。

圖1 各組皮膚切片Masson染色

2.2 皮膚組織衰老的β-半乳糖苷酶染色結果 老化細胞在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下生成藍色產物，正常對照組小鼠皮膚中沒有檢測到β-半乳糖苷酶陽性細胞；LAS低、中劑量組小鼠皮膚中可發現有零星的藍色顆粒即β-半乳糖苷酶陽性細胞散在分布；LAS高劑量組及衰老模型組小鼠皮膚切片中能檢測到較多的陽性細胞，說明LAS能夠促進小鼠皮膚組織的老化進程，見圖2。

2.3 小鼠皮膚組織中氧化應激指標的變化 LAS不同劑量組及衰老模型組MDA含量均明顯高于正常對照組，SOD及GSH-Px活性均低于正常對照組(P<0.01)；且隨LAS劑量增加，MDA含量有增加趨勢，而SOD及GSH-Px活性有降低的趨勢(P<0.05，P<0.01)。衰老模型組MDA含量高于LAS低劑量組，低于LAS高劑量組(P<0.05，P<0.01)，與中劑量組之間無統計學意義(P>0.05)；衰老模型組SOD活性高于LAS中、高劑量組(P<0.01)，與低劑量組之間無統計學意義(P>0.05)；衰老模型組GSH-Px活性低于LAS低劑量組(P<0.01)，與LAS中、高劑量組之間無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4 各組小鼠皮膚組織中Hyp的變化 LAS不同劑量組及衰老模型組Hyp均明顯低于正常對照組(P<0.01)；LAS各劑量組中，隨LAS劑量的增加Hyp有逐漸降低的趨勢(P<0.01)。衰老模型組低于LAS低、中劑量組(P<0.01)，與高劑量組之間無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖2 各組β-半乳糖苷酶染色(×400)

組別MDA(nmol/mgprot)T-SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)Hyp(μg/mg濕重)正常對照組4.16±0.23257.79±21.971185.15±58.840.38±0.04LAS低劑量組5.28±0.612)214.36±15.262)1129.42±85.471)0.30±0.032)LAS中劑量組5.92±0.662)3)203.65±10.502)969.06±49.352)4)0.26±0.022)4)LAS高劑量組6.70±0.502)4)5)183.70±10.262)4)6)914.88±54.042)4)0.17±0.022)4)6)衰老模型組5.97±0.682)3)7)219.94±15.892)5)7)944.11±75.532)4)0.18±0022)4)6)F/P值28.78/<0.0131.24/<0.0133.37/<0.0164.23/<0.01

與正常對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與LAS低劑量組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；與LAS中劑量組比較:5)P<0.05，6)P<0.01；與LAS高劑量組比較：7)P<0.01

3 討 論

β-半乳糖苷酶是一種鑒別細胞衰老標致酶〔7〕，隨著衰老的發生，在皮膚中的含量會不斷增加,β-半乳糖苷酶染色實驗可用于直觀鑒定皮膚細胞的衰老程度〔8〕。本結果說明了LAS與D-半乳糖相似，可促進皮膚細胞衰老的發生。本研究表明LAS可對小鼠皮膚組織造成氧化應激損傷，且隨LAS濃度增加，氧化應激有增加趨勢。與此結果相似，本實驗室前期研究中觀察到同劑量的LAS對小鼠灌胃60 d，能導致肝組織MDA含量增加，SOD及GSH-Px活性下降〔4〕，MDA含量增高及SOD、GSH-Px活性的降低是氧化應激損傷的主要指標，所以LAS通過氧化應激而產生對各組織的有害作用可能是其毒作用的主要機制之一。研究表明〔9,10〕，氧化損傷是人體組織衰老的重要機制之一，皮膚衰老與之密切相關。Hyp在膠原蛋白中較為穩定，約占13.4%，而膠原蛋白大多分布在結締組織，是真皮的主要成分，通過鉸鏈相互連接維持皮膚的韌性，隨著皮膚的衰老，膠原含量減少，因此Hyp的含量能反映結締組織疾病的膠原代謝情況，膠原含量的變化可提示皮膚老化程度〔11〕。D-半乳糖亞急性衰老模型被認為當前抗衰老研究的較好模型〔6〕，被廣泛應用，即在一定時間內通過皮下連續注射D-半乳糖，導致細胞代謝紊亂，自由基堆積等呈現衰老狀態，本文選擇此方法制作皮膚衰老模型以便于對LAS的研究。通過與衰老模型比較發現，中、高劑量LAS的大多指標可達到D-半乳糖所致衰老模型的程度。本研究結果證實了LAS能促進小鼠皮膚老化。但皮膚老化是一復雜的多因素參與的過程，除了上述指標，應對影響衰老的其他因素作進一步探討。

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〔2015-07-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目(KJ2014A159)；安徽省高等學校預防醫學特色專業基金資助項目(皖教高〔2011〕5號)

趙文紅(1967-)，女，碩士，副教授，碩士生導師，主要從事營養毒理學研究。

R151

A

1005-9202(2017)04-0825-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.017