17β-雌二醇降解菌紅球菌(Rhodococcussp.)DS201的分離鑒定及其特性研究

于清淼，王 平，劉東波，趙洪巖，邵緩緩，馬 喆，霍洪亮

(1.東北師范大學環境學院，吉林 長春 130117；2.南京大學環境學院，江蘇 南京 210023；3.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024)

17β-雌二醇降解菌紅球菌(Rhodococcussp.)DS201的分離鑒定及其特性研究

于清淼1，2，王 平3，劉東波3，趙洪巖3，邵緩緩1，馬 喆1，霍洪亮1

(1.東北師范大學環境學院，吉林 長春 130117；2.南京大學環境學院，江蘇 南京 210023；3.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024)

從北京一藥廠曝氣池的活性污泥中馴化、分離得到一株能以17β-雌二醇為唯一碳源生長的高效降解菌DS201.經過對其進行形態學、生理生化和16S rDNA序列分析，初步鑒定為紅球菌Rhodococcussp.分析了溫度、pH值、接種量、底物濃度等因素對DS201生長的影響.結果表明：DS201生長的最適溫度為30℃，最適pH=7，最佳接種量為2%，最適底物濃度為5 mg/L.通過正交實驗分析，DS201降解17β-雌二醇的最優條件是：溫度30℃，pH=7，接種量為1%；培養3 d能使1 mg/L 17β-雌二醇完全降解.通過質譜分析，17β-雌二醇的初級降解產物是雌酮.

17β-雌二醇；紅球菌屬；生物降解；雌激素活性

17 β-雌二醇(17 β-estradiol，E2)是一種天然雌激素，也是典型的環境內分泌干擾物，在我國內陸水系和近海水體中均能檢測到其存在.長江和太湖中E2濃度都在0.1 ng/L以上[1-2].天然雌激素污染對人或動物生長、發育危害極大.對水生生物的影響表現為雄性雌性化或雌雄同體、發育異常甚至死亡等.對人的影響表現為神經系統、免疫系統發育異常和生殖障礙，致畸和致癌等[3-5].Biegel等[6]的研究發現，生活在E2污染環境中的成年小鼠卵巢和睪丸發育均不正常；Vajda等[7-9]研究發現，生長在含有E2廢水的魚類出現生殖異常.此外，有研究還表明，E2污染與女性乳腺癌和男性前列腺癌、睪丸癌發病率的增加都有直接關系[10].

在眾多的天然雌激素中，E2被認為是潛在的危害最大的一類雌激素，主要通過人和生物體的尿液以及工廠廢水排放進入環境中，極低濃度水平(0.l ng/L) 的 E2便可造成明顯的影響[3，7].目前，降解污染水體中的E2已經成為國內外研究的熱點問題，很多學者對E2在環境中的分布、遷移和轉化等問題開展了一系列研究，也分離和鑒定出一些能夠降解E2的菌株，例如Fujisawa[11]分離出的E2降解菌Novosphingobiumsp.(ARI-1)等，但有關紅球菌的E2降解特性以及對E2降解條件優化的研究尚未見報道.

本研究從北京一藥廠曝氣池的活性污泥中馴化、分離獲得一株能以E2為唯一碳源和能源生長的細菌，經初步鑒定為紅球菌(Rhodococcussp.)，對該菌株的E2降解特性、降解條件和降解產物進行了研究，初級降解產物為雌酮.該項研究將為天然雌激素類降解的生物處理提供新的菌株材料，為構建和強化E2降解工程菌提供理論依據和試驗參數.

1 材料與方法

1.1 試劑

17 β-雌二醇(E2)為Sigma公司生產，色譜純(純度大于98%).其他藥品均為分析純.

1.2 樣品來源與培養基

樣品來自北京某生產避孕藥工廠的曝氣池泥樣.

無碳源的無機鹽液體培養基為：NaHPO44.26 g/L，KH2PO42.65 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，CaCl20.02 g/L.用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調pH=7.0.加入1 mL的微量元素，用蒸餾水定容至1 000 mL.

圖1 17β-雌二醇化學結構式

微量元素為：NiCl2·6H2O 0.024 g/L，CoCl2·6H20 0.19 g/L，H3BO30.006 g/L，ZnCl20.07 g/L，CuCl2·2H2O 0.002 g/L，MnSO4·H2O 0.061 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.024 g/L.

LB培養基為：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，調pH=7.4.固體培養基為LB液體培養基中添加2%的瓊脂.

碳源：17β-雌二醇，其化學結構式見圖1.

1.3 E2降解菌的富集、篩選和純化

將實驗所用各種玻璃器皿用蒸餾水洗凈備用.配制質量濃度為500 mg/L的E2母液，取1 mL母液加入到盛有100 mL無機鹽液體培養基的三角瓶中，使無機鹽液體培養基中E2的終濃度為5 mg/L.將三角瓶放入到恒溫水浴箱中，60℃水浴30 min，使甲醇完全蒸發，高壓滅菌.將泥樣按1∶10的體積比加入到液體培養基中，并加入體積比1∶10的實際污水，在30℃，120 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養72 h.從每瓶培養基中取200 μL菌液加入到新鮮培養基中，繼續培養7 d.按此法將菌液接種到含有E2質量濃度為20，40，60，80，100 mg/L的新鮮無機鹽液體培養基中培養(重復3次).

選擇E2降解率最高的樣品，取1 mL菌液用無菌水從10-2逐級稀釋至10-8，在LB固體培養基上進行涂布，做3個平行組.培養3 d，觀察菌落.用接種環挑取長勢好的菌落在LB固體培養基上進行多次劃線，直至分離出單個菌落.然后將單菌落接種到以E2為唯一碳源的無機鹽液體培養基中進行復篩，用試管斜面將能降解E2的單菌落4℃保存.

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態學觀察

利用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌落的形態特征[12]，測定菌落的外形大小，并對細菌進行革蘭氏染色.

1.4.2 生理生化指標

生理生化實驗參照《常見細菌系統鑒定手冊》[13]和《伯杰細菌鑒定手冊》[14].

1.4.3 菌株16S rDNA鑒定

參照《常見細菌鑒定手冊》，用細菌的通用引物通過PCR擴增技術擴增DNA.

上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

下游引物1492R：5′-TACCTTGTTACGATT-3′.

測序結果利用NCBI中的blast工具與GenBank數據庫中的16S rDNA基因序列進行同源性比較.并用軟件MEGA構建系統發育樹.

1.5 菌懸液的制備

將菌液在30℃，120 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h.用滅過菌的離心管4 000 r/min離心15 min，倒去上清液；加入pH=7的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，4 000 r/min再次離心15 min，倒去上清液.如此反復洗滌3次.用漩渦混合器將菌體打散，再用磷酸鹽緩沖溶液將菌液稀釋到D(600)的值為1.0，制成菌懸液備用.

1.6 E2降解菌特性研究

處理溫度設定為4℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃；pH值設定為：4，5，6，7，8，9，10，11；E2質量濃度設定為：0.5，1，5，10，40，60，80，100，150，200 mg/L；菌種初始接種量為：1%，2%，3%，5%，7%，9%，12%.研究菌株生長特性和E2降解特性.每個影響因素設置3個平行組，以不接菌的培養基作為空白對照.將菌株在30℃，120 r/min恒溫振蕩培養箱中培養3 d，測定在不同影響因素下的E2降解率和D(600).選用五因素四水平正交表設計正交實驗.

1.7 降解物及濁度分析與檢測

將樣品用乙醚等體積萃取，重復3次.萃取液用旋轉蒸發器蒸干，甲醇定容.0.22 μm濾膜過濾后加入色譜瓶.用高效液相色譜儀(HPLC，Wasters1525)測定雌激素濃度，檢測器為UV(DualλAbsorbance Detector，Water2487)，色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18柱(150 mm × 4.6 mm，3.5 mm).流動相體積比為V(乙腈)∶V(水)=1∶1，檢測器波長為275 nm，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，每個樣品重復檢測3次，取平均值.樣品的濁度用酶標儀在600 nm處檢測，用吸光度(D(600))表示.

E2初級降解產物用高效液相色譜與質譜聯用(HPLC-MS/MS)測定.高效液相色譜的測定條件如上所述；質譜測定條件：API2000質譜儀，ESI源，負離子掃描，蒸汽溫度400℃，毛細管溫度200℃，以不接菌株的樣品作為對照.

2 結果

2.1 E2降解菌的分離

圖2 菌株DS201電鏡照片

樣品富集馴化8周后，分離出20株能夠以E2為唯一碳源和能源生長的細菌.用高效液相色譜儀測定20株細菌對E2的降解率，用酶標儀測定吸光度.綜合E2降解率和濁度優選出1株最佳菌株，命名為DS201，將其作為后續研究菌種.

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態特征和生理生化指標

菌株DS201在LB培養基上，菌落呈圓形，表面圓潤，邊緣完整，粉色，不透明，直徑1.5～3.0 mm，革蘭氏染色陽性.掃描電鏡觀察，菌株DS201的形態呈球形，無鞭毛(見圖2).

菌株DS201的生理生化特性實驗結果見表1.

2.2.2 16S rDNA鑒定

將菌株DS201的16S rDNA的基因序列輸入到NCBI在線blast比對程序與GenBank基因庫中的核酸數據進行同源性比對檢索.比對結果表明，菌株DS201的16S rDNA基因序列與GenBank基因庫中的紅球菌屬(Rhodococcus)中的多株紅球菌和馬紅球菌的16S rDNA的基因序列有99%以上的同源性，結合菌株DS201的形態特征和生理生化指標，初步確定菌株為紅球菌，命名為紅球菌(Rhodococcussp.)DS201.選取紅球菌屬中的18個菌株的16S rDNA基因序列，并選取分枝桿菌屬(Mycobacterium)中的2個菌株16S rDNA基因序列做外群，使用MEGA軟件并根據Neighbor-Joining進行系統進化樹分析，構建的無根系統發育樹見圖3.

圖3 菌株DS201的系統發育樹

2.3 DS201 E2降解特性

溫度對菌株DS201降解E2的影響：菌株DS201隨著溫度的升高降解E2的能力明顯提高.當溫度到達30℃時，E2降解率達到最高.溫度再升高，E2降解率逐漸下降.說明菌株DS201 E2降解最適溫度為30℃(見圖4a).

圖4 菌株DS201降解E2特性

pH值對菌株DS201降解E2的影響：菌株DS201在pH=4時，降解率很低；在pH=6～8時，降解率較高；在pH=7時，降解率最高.說明菌株DS201的E2降解最適初始pH=7(見圖4b).

底物濃度對菌株DS201降解E2的影響：當E2的質量濃度為0.5～5 mg/L時，降解率隨著濃度增加逐漸升高；當E2的質量濃度為5～60 mg/L時，E2的降解出現一定程度的抑制；當E2的質量濃度為60～200 mg/L時，E2的降解雖然受到一定程度的抑制，但隨著濃度的增加不再出現明顯下降的情況.說明該菌株具有較強的抵抗生物毒性的能力.菌株DS201降解E2的最適底物質量濃度為5 mg/L，降解率達到89.1%；在質量濃度為200 mg/L時，降解率為39.2%(見圖4c).

接種量對菌株DS201降解E2的影響：當菌株DS201的接種量在2%時，E2的降解率最高，隨著接種量的增加，E2的降解率受到明顯抑制.說明菌株DS201降解E2的最適接種量為2%(見圖4d).

選擇溫度、pH、底物質量濃度和接種量進行正交實驗.對正交實驗數據進行極差分析，結果見表2.

表2 菌株DS201降解E2條件優化的極差分析

由表2的極差分析可知，溫度對菌株DS201降解E2的影響最大，隨著溫度的變化平均降解率出現明顯變化，30℃平均降解率最高.底物濃度對菌株DS201降解E2的影響次之，隨著底物濃度的升高，平均降解率先升高再降低，底物質量濃度為1 mg/L的平均降解率最大.再次是pH對菌株DS201降解E2的影響，在偏酸和偏堿環境中E2的平均降解率都沒有中性環境的降解率高.最后是接種量對菌株DS201降解E2的影響，隨著接種量的增加，E2的平均降解率下降，這可能是營養物質的量限制了菌株E2的降解能力.

將正交實驗數據使用軟件SPSS(statistical product and service solutions)進行方差分析，P<0.05為差異顯著，結果見表3.由表3可見，溫度和底物質量濃度對DS201降解E2的影響特別顯著，pH對DS201降解E2的影響非常顯著，而接種量對DS201降解E2的影響顯著.所以，因素主次順序為：溫度—底物質量濃度—pH—接種量.結合正交實驗的極差分析和方差分析，以降解率為指標，菌株DS201降解E2的最優水平組合為溫度(3)-底物濃度(2)-pH(3)-接種量(1)，即溫度為30℃、底物質量濃度為1 mg/L、pH=7、接種量為1%時，降解率達到最高.

表3 菌株DS201降解E2條件優化的方差分析

aR2=0.996.

2.4 中間代謝產物測定

用HPLC-MS/MS檢測菌株DS201降解E2的代謝產物，測得的實驗結果見圖5.

圖5 菌株DS201降解E2中間產物的高效液相色譜-質譜聯用分析結果

續圖5

圖5a的5號峰和圖5b的5號峰為E2峰，保留時間為9.7 min.通過比較圖5a與圖5b，推測圖5b的7號峰為中間代謝產物峰.對圖5b的5號峰和7號峰進行質譜檢測，結果見圖5c和圖5d.對比這兩幅質譜圖發現荷質比為269.1的物質可能為代謝產物，因此對其進行二級質譜檢測，結果見圖5e.由圖5e可見，荷質比為269.1的物質是一個完整的物質，故確定其為E2的初級代謝產物.將該物質的相對分子質量為270輸入NIST Chemistry WebBook 數據庫，找到對應的物質，并結合E2化學鍵斷鍵和成鍵規律，確定E2的初級代謝產物為雌酮(estrone，E1).

3 結論

從北京某生產避孕藥工廠的曝氣池活性污泥中馴化、分離得到20株能以17 β-雌二醇為唯一碳源生長的降解菌株，經過進一步篩選，得到了一株降解率高且穩定的降解菌DS201.經過對其進行形態學、生理生化指標以及16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株為紅球菌(Rhodococcussp.).通過單因素實驗得到了DS201最適的降解條件為：溫度30℃、pH=7、最佳接種量為2%、底物濃度為5 mg/L.通過正交實驗優化降解條件，結果表明，菌株DS201在溫度30℃，pH=7，接種量1%，培養3 d能夠完全降解底物質量濃度為1 mg/L的17 β-雌二醇.通過HPLC-MS/MS聯用鑒定出17 β-雌二醇的初級代謝產物是雌酮.

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(責任編輯：方 林)

Isolation，identification of 17 β-estradiol-degradingRhodococcussp.strain DS201 and its degradation characteristics

YU Qing-miao1，2，WANG Ping3，LIU Dong-bo3，ZHAO Hong-yan3， SHAO Yuan-yuan1，MA Zhe1，HUO Hong-liang1

(1.School of Envionment，Northeast Normal University，Changchun 130117，China； 2.School of the Environment，Nanjing University，Nanjing 210023，China； 3.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

A novel bacterium capable of degrading 17 β-estradiol(E2) was isolated from the activated sludge collected from wastewater treatment plant of pharmacy factory mainly producing contraceptive medicine in Beijing.According to its morphology，physiochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis，this strain was identified asRhodococcussp. By tests in shaking flasks，the effects of the conditions of growth was studied，and it was determined that the optimum conditions of growth for the strain was 30℃，pH=7 and inoculum amount 2% and E2 initial concentration of 5 mg/L.The degrading conditions for strain DS201 was further optimized by tests in orthogonal tests.The results showed that the conditions for the degradation of E2 by strain DS201 were 30℃，initial pH=7，and inoculum amount 1%，this strain could degrade E2 completely within 3 d with intial concentration of 1 mg/L.Mass spectrum analysis demonstrated estrone that the main catabolic intermediates during E2 degradation.

17 β-estradiol；Rhodococcussp；biodegradation；estrogenic activities

1000-1832(2017)01-0140-08

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.01.026

2015-11-20

國家自然科學基金資助項目(51478096).

于清淼(1990—)，男，博士研究生；通訊作者：霍洪亮(1963—)，男，教授，主要從事污水處理與資源化研究.

X 799.3 [學科代碼] 610·30

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