丹參蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表達分析

賈彥彥+汝梅+金偉波+梁宗鎖

[摘要]蔗糖非酵解型蛋白激酶家族2（SnRK2）在逆境植物信號轉導途徑中起著重要作用。該研究根據丹參轉錄組數據從丹參cDNA中克隆得到一個SnRK2家族基因，命名為SmSnRK24，屬于Ⅰ類SnRK2。SmSnRK24基因包含8個內含子，9個外顯子，其開放閱讀框1 068 bp，編碼355個氨基酸，推測其蛋白相對分子質量為4063 kDa，將其構建到原核表達載體pMALc2X上，原核誘導表達出與預測蛋白大小一致的目的蛋白。依據丹參基因組序列，PlantCARE分析SmSnRK24起始密碼子ATG上游3 000 bp的啟動子系列，結果顯示該序列包含Ibox，GAmotif，HSE，LTR，TCrich repeats等逆境脅迫響應元件，以及GAREmotif，Pbox，ABRE，CGTCAmotif等激素響應元件。實時熒光定量PCR分析表明SmSnRK24在丹參根中的含量較高，在莖中和葉中含量相當，ABA和PEG脅迫響應分析表明，SmSnRK24對PEG滲透脅迫響應顯著，對ABA脅迫響應微弱。該研究為進一步探討SmSnRK24基因在丹參干旱脅迫下次生代謝產物積累機制中的作用奠定了基礎。

[關鍵詞]丹參； SmSnRK24； 原核表達； 啟動子； 實時熒光定量PCR

Cloning and expression analysis of protein kinase

SmSnRK24 from Salvia miltiorrhiza

JIA Yanyan1， RU Mei2， JIN Weibo3， LIANG Zongsuo1，3*

（1 College of Life Science， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100， China；

2 Institute of Soil and Water Conservation， Chinese Academy of Sciences and the Ministry of Water Resources， Yangling 712100， China；

3 College of Life Science， Zhejiang SciTech University， Hangzhou 310018， China）

[Abstract]Sucrose nonfermenting 1related protein kinase 2（SnRK2） plays a key role in abiotic stress signaling in plants In this study， we cloned a SmSnRK24 gene belonging to subclass I of SnRK2 from Salvia miltiorrhiza by screening its transcriptome database The SmSnRK24 gene contains 8 introns and 9 exons， with a 1 068 bp open reading frame encoding a polypeptide of 355 amino acids， the predicted molecular mass of which is 4063 kDa Prokaryotic expression of SmSnRK24 protein using pMALc2X as the expression vector displayed that the recombinant protein of SmSnRK24 gene in E coli was consistent with the predicted size A 3 000 bp promoter sequence of SmSnRK24 contained some stressresponsive elements and hormoneresponsive elements Quantitative realtime PCR analysis revealed that the expression of SmSnRK24 in root was much higher than that in stem and leaf， SmSnRK24 was strongly induced by PEG stress， weakly induced by ABA stress This research provided a basis for further study of the SmSnRK24 gene playing the role in accumulate mechanism of secondary metabolites in S miltiorrhiza under drought

[Key words]Salvia miltiorrhiza； SmSnRK24； prokaryotic expression； promoter； quantitative realtime PCR

丹參，為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，是傳統大宗藥材之一，主要活性成分為水溶性酚酸類化合物和脂溶性丹參酮類。丹參基原植物具有生命力強、世代周期短、組織培養和轉基因技術成熟、基因組小、染色體數目少等特點，并且隨著丹參轉錄組信息、全基因組信息的逐步豐富，丹參已被認定為中藥研究的理想模式植物[12]。

目前，干旱脅迫成為影響植物生長發育的最嚴重因子之一，植物在干旱脅迫的環境中會改變細胞內次生代謝產物的積累[3]。丹參是干旱敏感種，在干旱脅迫下通過酚酸類物質積累抵御干旱氧化脅迫[4]。中度干旱脅迫顯著促進丹參活性成分的積累已得到研究者們的一致認同[59]，在此基礎上，劉曉蕾從代謝途徑著手，初步研究了中度脅迫下顯著提高丹參葉片總酚酸含量積累的機制，即在干旱條件下通過啟動水溶性代謝途徑關鍵酶的活性從而調控酚酸類物質的積累[10]。

諸多研究表明，在面對干旱脅迫時，植物體內ABA的快速積累對植物響應干旱脅迫起著重要的作用[11]。SnRK2家族作為ABA信號轉導途徑中重要成員，已在擬南芥、玉米、水稻、蘋果、馬鈴薯和草莓等物種中得到克隆和功能分析研究[1217]。然而，當前有關SnRK2s在藥用植物上的研究幾乎空白，限制了其在提高逆境下藥用植物次生代謝含量方面的應用。

通過對丹參SnRK2家族成員之一SmSnRK24的分析，將有助于通過基因工程手段提高干旱脅迫下丹參有效成分的含量。聚乙二醇6000（PEG6000）是一種親水性很強的大分子聚合物，其自身不能通過植物細胞壁而滲入活細胞內，且無毒性，但能使細胞緩慢吸水，利用聚乙二醇作為誘導劑模擬干旱條件具有簡單快速、周期短、重復性好等特點，因此，近年來常被廣泛用于植物的耐旱性分析[1819]。研究表明，PEG能模擬干旱脅迫的原因是其可阻塞植物的輸導組織，且其模擬干旱脅迫與土壤控水的結果相同[2022]，當15%≤PEG≤25%時即可模擬中度干旱脅迫[2324]。

本研究首次以藥用模式植物丹參為材料，對SmSnRK24基因進行了生物信息學分析，原核表達分析，啟動子分析和組織特異性分析，同時也分析了在ABA處理和PEG模擬中度干旱脅迫下SmSnRK24基因的響應情況，旨在為深入研究丹參SmSnRK24基因功能奠定基礎，同時為了解丹參中ABA信號轉導途徑提供科學積累。

1材料

11植物將丹參種子播種于穴盤中，組培間培養，種子萌發并長出一對真葉后移栽至營養缽中，每個營養缽3棵幼苗，培養至60 d時用于各種分析。組織特異性分析：分別取60 d齡丹參幼苗的根、莖和葉于液氮中迅速冷凍，置于-80 ℃冰箱凍存備用。ABA處理和PEG處理：分別用100 μmol·L-1 ABA和20% PEG溶液噴灑并澆灌丹參苗，樣品分別于處理后0，05，1，3，6，9，12，24 h進行收集，以對應條件下的H2O處理作為對照，材料收集后液氮速凍，置于-80 ℃冰箱凍存備用。

12菌種及載體pMALc2X購于NEB有限公司，大腸桿菌DH5α感受態購于康為世紀生物科技有限公司，T載體（pEASYBlunt Simple Cloning Kit）購自全式金生物技術有限公司，宿主菌Rosetta本實驗室保存。

13工具酶及主要試劑pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性核酸內切酶購于Thermo公司，RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（DP432）購于北京天根生化科技有限公司，相對分子質量標準200 bp Ladder、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購于TaKaRa有限公司，DNA回收純化試劑盒和質粒提取試劑盒均購自OMEGA公司，預染蛋白Marker購于北京全式金生物技術有限公司，PCR引物均由北京奧科技術有限公司合成。

2方法

21總RNA提取及DNA提取參照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒的使用說明書進行丹參植物根、莖、葉以及對照和處理材料總RNA的提取，用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并利用核酸濃度檢測儀測定獲得RNA的濃度及純度。RNA反轉錄為cDNA依據TaKaRa反轉錄試劑盒的操作步驟進行。DNA提取采用改良的CTAB法。

22SmSnRK24基因cDNA的克隆和基因組序列的獲得以擬南芥SnRK2基因家族保守序列為參考，從丹參轉錄組數據庫中Blast丹參SnRK2s基因，篩選出的其中1條SnRK2基因長1 846 bp，用Primer Premier 50軟件設計基因特異性引物。上游引物：5′GATACACAAACCCACTCTGCACTAC3′，下游引物：5′CAAGAAAATACAGAAGTTCTCATC3′，分別以反轉錄的cDNA和DNA為模板進行擴增。在25 μL擴增體系中含無RNA酶水172 μL，dNTP Mixture（25 mmol·L-1） 2 μL，10×Pfu buffer 25 μL（含MgSO4），引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板1 μL，Pfu DNA Polymerase 03 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，33個循環；最后72 ℃再延伸8 min。PCR擴增出的特異片段回收、連接至pEASYBlunt Simple載體中，25 ℃連接15 min后，轉入大腸桿菌DH5α感受態中，涂布在加氨芐青霉素（終濃度為100 mg·L-1）的LB平板上，37 ℃培養過夜。挑取生長良好的單克隆于加氨芐青霉素的液體LB培養基中活化，菌液PCR驗證，選擇陽性菌液送上海立菲生物技術有限公司進行測序，獲得SmSnRK24pEASY重組質粒。

賈彥彥等：丹參蛋白激酶SmSnRK24的克隆及表達分析23SmSnRK24基因的生物信息學分析將測序所得的cDNA序列通過NCBI在線比對（https：//blastncbinlmnihgov/Blastcgi），找出與其同源性較高的其他物種的氨基酸序列，然后用DNAMAN軟件進行同源性比較；從NCBI網站下載模式植物擬南芥和雙子葉植物蘋果的SnRK2家族成員氨基酸序列，應用MEGA606使用NJ法（bootstrap 1000）構建系統進化樹；利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorfhtml）中的ORFfinder和GENSCAN在線軟件（http：//genes.mit.edu/GENSCANhtml）分析其ORF序列；利用GSDS20在線軟件（http：//gsds.cbi.pkueducn/）分析基因的內含子和外顯子序列；利用Expasy工具（http：//web.expasy.org/protparam/）進行氨基酸殘基數目、組成、蛋白質相對分子質量、理論等電點和親、疏水性的在線分析；利用Expasy工具中的SOPMA軟件（https：//npsaprabiibcpfr/cgibin/npsa_automatpl？page=/NPSA/npsa_sopmahtml）在線預測分析α螺旋、β折疊和無規則卷曲；利用Expasy工具中的SWISSMODEL（http：//swissmodelexpasyorg/）進行蛋白的三維結構預測；利用NetPhos 20 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/NetPhos/）對SmSnRK24蛋白進行磷酸化位點分析。

24SmSnRK24蛋白原核表達根據SmSnRK24基因的ORF序列，設計上游引物F：5′CGCGGATCCATGGAGAAATAC3′（下劃線處為保護堿基和BamHⅠ酶切位點），下游引物R：5′GACGTCGACCTAAGTGATACG3′（下劃線處為保護堿基和SalⅠ酶切位點），以上述重組質粒SmSnRK24pEASY為模板進行擴增，將PCR產物連接到表達載體pMALc2X的BamHⅠ和SalⅠ酶切位點處，獲得重組質粒SmSnRK24pMAL，將鑒定和測序正確的重組質粒和空的表達載體分別轉化到大腸桿菌Rosetta中，挑取重組菌的單菌落接種至含有氨芐霉素的LB液體培養基中，37 ℃培養過夜，然后按照1∶100稀釋到含有抗生素的LB液體培養基中，當A600達到06～08的時候分別加入01，03，05，07，09 mmol·L-1 IPTG誘導表達，22 ℃誘導16 h。取誘導后菌液1 mL，4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，棄上清，用PBS重懸沉淀，取20 μL重懸液加入5 μL的 5×蛋白loading buffer，沸水浴5 min，SDSPAGE進行分析。

25SmSnRK24基因啟動子分析SmSnRK24基因的5′側翼序列根據丹參基因組序列分析所得。轉錄應答元件的分析采用PlantCARE database （http：//bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare /html/）進行。

26SmSnRK24基因表達分析利用實時熒光定量PCR對SmSnRK24在丹參不同器官及不同脅迫處理條件下的表達進行分析。所使用的定量引物序列為F： 5′TTGCCAACTCTTCTAGGAGAAT3′，R： 5′GGTTCTCTTTGCGGTAATACAC3′。PCR的反應體系如下：125 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，cDNA模板（150 mg·L-1）2 μL，加水補足至25 μL，3個平行重復。擴增程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40個循環。溶解曲線程序：從65 ℃以每5 s 05 ℃的速度升至95 ℃。以植物的管家基因之一βactin基因作為內參，利用2-ΔΔCt法計算相對表達量。所有處理均設3個生物學重復。實時熒光定量PCR數據利用CFX Manager（BioRad，USA）處理分析，利用SPSS軟件（Version 160）進行顯著性分析。

3結果與分析

31SmSnRK24基因全長cDNA和基因組DNA序列的獲得根據擬南芥的10個SnRK2家族成員的保守序列，利用本地Blast檢索程序，從丹參轉錄組數據庫中Blast丹參SnRK2s基因，搜索出的其中1條SnRK2基因序列長1 846 bp，將其通過NCBI的blastX比對，確定其為SnRK2家族成員，命名為SmSnRK24，根據該序列設計特異引物，以反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增出與目的大小一致的單一特異條帶，見圖1A。將其回收、克隆送去測序，分析測序結果，與目的序列完全吻合，無堿基缺失或替換情況。為了分析其基因組序列信息，以丹參DNA為模板，用上述特異引物進行PCR擴增，擴增出大小在3 000 bp左右的單一特異條帶，回收、克隆測序，測序結果分析顯示：該特異條帶大小為3 136 bp，見圖1B。

32SmSnRK24基因的生物信息學分析結合ORFfinder和GENSCAN在線軟件分析，確定1 846 bp 的SmSnRK24 cDNA序列中包含開放閱讀框（ORF）1 068 bp，位于序列的483～1 550 bp位置，將ORF序列與獲得的DNA序列比對，查找DNA序列中的內含子，結果顯示：SmSnRK24含有8個內含子，9個外顯子，剪切位點符合GU/AG規則，內含子和外顯子的分布情況見圖2。SmSnRK24基因編碼355個氨基酸，將其氨基酸序列通過NCBI Blastp 比對表明，與其他物種的SnRK2相似度較高，見圖3。與唇形目芝麻Sesamum indicum、鼠李目葡萄Vitis vinifera、茄目甜辣椒Capsicum annuum、茄目煙草Nicotiana tabacum的SnRK2基因氨基酸序列相似度分別達到91%，90%，93%，92%，說明SnRK2基因家族的保守性很強。通過與擬南芥SnRK2家族的10個基因和蘋果SnRK2家族的10個基因的氨基酸聚類分析發現，SmSnRK24屬于SnRK2家族第Ⅰ亞家族，見圖4。

利用Expasy工具分析顯示，SmSnRK24編碼蛋白相對分子質量為40637 kDa，等電點為585，平均親水系數（GRAVY）為-0533，二級結構分析結果表明，SmSnRK24的二級結構中α螺旋占4225%，

β轉角占817%，無規則卷曲占3127%，延伸鏈占1831%；三維結果預測發現，SmSnRK24預測編碼蛋白三級結構與二級結構預測結果相符合；NetPhos 20 Server分析結果表明，SmSnRK24有9個絲氨酸磷酸化位點，3個蘇氨酸磷酸化位點，6個酪氨酸磷酸化位點。

33SmSnRK24蛋白原核表達SmSnRK24的ORF片段與表達載體pMALc2X的連接產物轉入大腸桿菌DH5α中，進行菌液PCR驗證，將經鑒定后的陽性克隆提取重組質粒，進行雙酶切鑒定，將菌液PCR和酶切鑒定均為陽性克隆的質粒送測序，測序結果顯示基因序列正確插入表達載體pMALc2X中。

將重組質粒和空載體pMALc2X分別轉入大腸桿菌Rosetta中，加入不同濃度的IPTG誘導后，收集菌體，PBS重懸，加蛋白上樣緩沖液煮沸，經12% SDSPAGE電泳分析，含有重組質粒的菌體經IPTG誘導出目的條帶，見圖5中方框所示。表明重組質粒在大腸桿菌中成功表達，此外，從圖中可以看出在IPTG濃度為05，07，09 mmol·L-1時，蛋白誘導量相對較多。

34SmSnRK24啟動子分析利用PlantCARE Database對約為30 kb的丹參SnRK24基因5′側翼序列進行分析，結果顯示，該啟動子序列中含有包含Ibox，GAmotif，HSE，LTR，TCrich repeats等逆境脅迫響應元件，以及GAREmotif，Pbox，ABRE，

CGTCAmotif等激素響應元件。部分響應元件見表1，推測該基因的表達可能受到上述各因素的調控。

35SmSnRK24的表達分析在丹參不同部位中的表達：以移栽培養60 d的丹參幼苗為材料，

M預染蛋白marker； 1空pMALC2X未誘導蛋白樣； 2空pMALC2X誘導蛋白樣； 3融合蛋白未誘導蛋白樣； 4融合蛋白01 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白樣； 5融合蛋白03 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白樣； 6融合蛋白05 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白樣； 7融合蛋白07 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白樣； 8融合蛋白09 mmol·L-1 IPTG誘導蛋白樣。

以丹參管家基因之一βactin為內參，利用實時熒光定量PCR分析SmSnRK24基因在丹參根、莖、葉中的表達，把莖中目的基因的表達量設為1，測定根

元件名稱功能ABRE參與ABA響應的順式作用元件AuxRRcore參與生長素響應的順式作用元件CAATbox真核生物常有的增強調節區CGTCAmotif參與茉莉酸甲酯響應的順式作用元件Gbox/Ibox參與光響應的順式調節元件HSE參與熱脅迫的順式作用元件MBS參與干旱誘導的MYB結合位點TATAbox位于轉錄起始位點上游約-30 bp處，真核生物啟動子基本元件TCrich repeats脅迫反應相關響應元件GAREmotif/Pbox赤霉素響應元件LTR低溫響應作用元件TCAelemen水楊酸響應作用元件

和葉中目的基因相對于莖的表達量。結果顯示，基因在所有檢測部位中均有表達，在根中的表達量最高，在莖中和葉中的表達量幾乎相同，見圖6。

ABA和PEG脅迫處理下的表達：以移栽培養60 d的丹參幼苗為材料，進行PEG和ABA處理，利用實時熒光定量PCR對不同處理條件下目標基因的表達情況進行分析。該基因對PEG脅迫響應顯著，快速響應PEG誘導，在05 h時達到高峰，經過1 h時的迅速下降后，3 h 時又恢復高峰，之后開始逐漸降低，在12 h時降到最低表達水平后，24 h上升達到最高峰；ABA對該基因的誘導效果甚微，基因的轉錄水平僅在9 h時出現顯著升高，在05，1，6 h時出現了不同程度的下調，在3，12，24 h時則不受ABA誘導，見圖7。

4討論

SnRK2是植物體特有的一類Ser/Thr類蛋白激酶，研究表明，SnRK2家族成員在ABA信號轉錄途徑和抗滲透脅迫中扮演著重要的角色。針對SnRK2家族成員對干旱和ABA脅迫響應的情況，相關研究表明：在擬南芥SnRK2家族的10個成員當中，9個能夠被高滲脅迫所激活，其中只有5個能夠被ABA所誘導[12]；在玉米11個SnRK2家族成員中5個受ABA激活[14]；在水稻10個SnRK2成員，所有的家族成員都受高滲脅迫的誘導，其中有3個成員受ABA的誘導[13]；小麥中TaSnRK23/24/28對外源ABA和干旱脅迫具有不同程度的響應[2527]；馬鈴薯中8個SnRK2基因均受PEG誘導表達，而外源ABA只能誘導StSnRK23基因的表達[16]。從系譜發生的分析中，SnRK2基因家族被分為3個亞家族，分別為groupⅠ，groupⅡ，groupⅢ，研究表明，groupⅠ不受ABA的激活，groupⅡ對ABA具有微弱的響應或不響應，而groupⅢ受ABA的強烈激活，所有的基因除AtSnRK29外，均受高滲脅迫的誘導[1213，28]。

目前，對SnRK2家族成員的功能在模式植物和一些大田作物中已得到了較為充分的闡述，然而，在藥用植物中的研究還相對較少，作為藥用模式植物丹參，隨著其轉錄組和基因組信息的豐富，為研究目標基因提供了極大的便利。

本研究首次從丹參轉錄組中篩選得到了丹參的SnRK2家族成員之一SmSnRK24基因，對其基因特性和空間結構進行了生物信息學分析，并構建了該基因的原核表達載體，成功地在大腸桿菌中表達，這為后續SmSnRK24的功能研究奠定了基礎。利用實時熒光定量PCR技術檢測其在PEG模擬的干旱脅迫和ABA脅迫下的表達水平，結果顯示：SmSnRK24基因受PEG和ABA的誘導，這與啟動子作用元件的預測結果相一致，其對PEG脅迫的響應較為迅速且強烈，呈現波浪形趨勢，這與TaSnRK23/24/28和NtSnRK28基因在PEG脅迫下的表達趨勢基本相似，這可能是由SnRK2s家族基因對逆境脅迫的響應機制所決定，詳細機理的闡述還有待進一步研究[2527，29]。其對ABA脅迫的響應微弱，結合對SmSnRK24基因磷酸化位點分析結果，推測該基因可能通過磷酸化修飾后參與植物抗逆途徑，屬于ABA非依賴型。

適當干旱脅迫有助于提高丹參有效成分的含量，而在抗滲透脅迫中扮演著重要的角色的SmSnRK24是如何調節丹參有效成分的含量，其通過何種信號轉導途徑來調節丹參有效成分含量，這都是后續要努力的方向，本研究為后續研究提供了科學的理論依據。

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[責任編輯呂冬梅]

[收稿日期]20160709

[基金項目]國家自然科學基金項目（81373908）；浙江省自然科學基金項目（LZ16H280001）；科技部“十二五”科技支撐項目（2015BAC01B03）

[通信作者]梁宗鎖，Email：liangzs@msiswcaccn

[作者簡介]賈彥彥，博士研究生，主要從事藥用植物次生代謝分子調控機理研究，Email：xiyanaidi@163com