一貫煎“異病同治”的網絡藥理學分析＊

楊夢蝶，蔡菲菲，武 容，陳曉樂，潘秋莎，胡元佳，蘇式兵＊＊

（1.上海中醫藥大學中醫復雜系統研究中心 上海 201203；2.澳門大學中藥質量研究國家重點實驗室 澳門 999078）

一貫煎（散劑）出自《柳洲醫話》，是清代魏之秀之方，由北沙參（三錢）、麥冬（三錢）、當歸（三錢）、生地黃（十錢）、川楝子（一錢半）、枸杞子（四錢）六味中藥組成。本方重用生地黃，重滋補，輕柔肝理氣，主治肝腎陰虛，肝氣不舒之證。證見胸脘脅痛，吞酸吐苦，咽干口燥，舌紅少津，脈細弱或虛弦。近年來，研究者們開展了一貫煎對多種疾病的臨床和實驗研究[1,2]，但其“異病同治”的療效機制尚未解明。中藥復方不同于天然藥物或西藥，是多成分、多靶點、多途徑和多效應[3]的復雜系統。因此，需要適合的技術和方法來探討中藥復方的復雜作用機制。

網絡藥理學作為新興的學科，是從系統生物學和生物網絡平衡的角度闡釋疾病的發生發展過程、從改善或恢復生物網絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發現的[4]。其通過公共數據庫和公開發表的數據，建立特定藥物作用機制網絡預測模型，或進行大通量檢測獲取相關信息，并采用生物信息學的手段分析和構建藥物-靶點-疾病網絡等，解析藥物的網絡藥理學機制，預測潛在治療疾病及相關作用靶點和通路等，在探索中藥復方治療疾病的作用機制和新藥的發現有廣闊的前景。本研究旨在通過網絡藥理學技術構建一貫煎成分-靶點-疾病網絡，分析一貫煎的作用靶點、生物過程和通路，預測其治療不同疾病肝腎陰虛證“異病同治”的機制及新的臨床適應病癥，并為發現新的藥物提供線索。

1 方法

1.1 一貫煎成分、靶點及疾病查詢與篩選

運用中藥綜合數據庫TCMSP[5]（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）、TCM database@Taiwan[6]（http://tcm.cmu.edu.tw）、TCMID[7]（http://www.megabionet.org/tcmid）、HIT[8]（http://lifecenter.sgst.cn/hit）以及化學數據庫TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp）查找一貫煎中北沙參、麥冬、當歸、生地黃、枸杞子、川楝子的所有化學成分。然后，在TCMSP和Drugbank[9]（http://www.drugbank.ca）中查找化學成分對應的靶點和疾病，去除無靶點對應的化學成分，刪除重復的靶點和疾病。而且，運用PubChem[10]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）尋找化學成分的別名。

1.2 口服生物利用度和類藥性指數篩選

口服生物利用度[11,12]（Oral bioavailability，OB）是指經口服途徑給藥后藥物吸收進入全身血液循環的相對量。它是藥物特性中最重要的藥代動力學參數之一。類藥性指數[13]（Drug-likeness，DL）是化合物與Drug?bank數據庫里已知藥物的相似性。具有類藥性的化合物并不是藥物，但是具有成為藥物的可能，這一類化合物稱為類藥性分子或藥物類似物分子。本研究中，我們在TCMSP中找到各個化學成分的口服生物利用度（OB）和類藥性指數（DL），并篩選出其中OB≥30%并且DL≥0.18的成分作為活性成分。

1.3 網絡構建與數據分析

通過Uniprot[14]數據庫（http://www.uniprot.org/）查找靶點的基因名稱和編號，再運用Cytoscape[15]3.4.0軟件構建：①一貫煎中藥成分-靶點的網絡：每個化學成分和其作用靶點通過直線連接起來；②一貫煎中藥成分-靶點-疾病的網絡：靶點與其對應的疾病通過直線連接起來，通過靶點，中藥成分與疾病連接起來。網絡圖中代表化學成分、靶點、疾病的點稱為節點。并運用Cytoscape3.4.0中的插件Network Analyzer分析兩個重要拓撲參數：節點度（Degree）和中介中心度（Between?nessCentrality）。

1.4 通路分析

運用David[16]在線軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對一貫煎靶點的GO生物學過程（Gene Ontology Biologi?cal Process，GO-BP）和KEGG通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG Pathway）進行富集分析。

2 結果

2.1 一貫煎化學成分篩選

經過五個數據庫的查詢，我們查找出各個中藥含有化學成分分別為北沙參122個、麥冬95個、當歸288個、生地黃71個、枸杞子212個、川楝子61個，其中有靶點對應并且有OB和DL值記錄的北沙參化學成分有54個，麥冬11個，當歸220個，生地黃37個，枸杞子199個，川楝子43個。經OB（≥30%）、DL（≥0.18）篩選后，一貫煎一共有活性成分49個（表1），其中北沙參7個，當歸3個，生地黃1個，川楝子2個，枸杞子29個，另外異珊瑚菜素（Cnidilin）是北沙參、當歸的共同化學成分，β共谷甾醇（beta-sitosterol）是北沙參、麥冬、生地黃、當歸、枸杞子的共同化學成分，豆甾醇（Stigmaster?ol）是北沙參、麥冬、當歸、川楝子、枸杞子的共同化學成分，槲皮素（quercetin）是北沙參、川楝子、枸杞子的共同化學成分，菜油甾醇（campesterol）是生地黃、枸杞子的共同化學成分，十八碳-6,9-二烯酸乙酯（Mande?nol）和亞麻酸乙酯（Ethyl linolenate）是川楝子、枸杞子的共同化學成分。

2.2 中藥成分-靶點的網絡構建與分析

在Drugbank和TCMSP數據庫中查詢篩選出的49個一貫煎活性成分，找到200個對應的靶點。運用Cy?toscape軟件，構建一貫煎成分-靶點網絡（圖1A）。該網絡中有417條邊，代表成分和靶點的相互作用關系。網絡中的249個節點里有49個代表成分，成分節點平均度為8.51，大于平均節點度的成分有9個成分；代表靶蛋白的節點為200個，其節點平均度為2.09，大于平均節點度的靶蛋白有30個。根據這9個成分和30個靶蛋白的相互關系，構建一貫煎成分-靶點核心網絡（圖1B）。

圖1中淺藍色三角代表北沙參獨有成分；深藍色三角代表當歸獨有成分；紫色三角代表生地黃獨有成分；紅色三角代表川楝子獨有成分；黃色三角代表枸杞子獨有成分；綠色橢圓代表北沙參、當歸共有成分；淺藍色橢圓代表北沙參、麥冬、生地黃、當歸、枸杞子共有成分；深藍色橢圓代表北沙參、麥冬、當歸、川楝子、枸杞子共有成分；紫色橢圓代表北沙參、川楝子、枸杞子共有成分；紅色橢圓代表生地黃、枸杞子共有成分；黃色橢圓代表川楝子、枸杞子共有成分；深藍色方塊代表靶點。

2.3 中藥成分-靶點-疾病網絡構建與分析

為了闡明一貫煎多成分、靶標以及疾病之間的相互關系，我們在TCMSP數據庫中查找出靶點相關疾病264個，用Cytoscape軟件，構建一貫煎成分-靶點-疾病網絡（圖2A），網絡中有915條邊，代表中藥成分、靶點

個節點代表疾病，平均節點度為3.47，大于平均節點度的有28個疾病。我們分別篩選同時大于中介中心性（BetweennessCentrality）、接近中心性（ClosenessCen?trality）平均值和平均節點度的節點，并將兩者一起與上述大于平均節點度的節點做交集，得到6個活性成分，包括松柏苷（coniferin）、阿托品（Atropine）、黃豆黃素（glycitein）、β胡蘿卜素（beta-carotene）、β谷甾醇（be?ta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol），42個靶點，28個疾病。構建中藥成分-靶點-疾病核心網絡（圖2B）。圖中圖標越大表示節點度越大，邊線越粗表示邊介數越大。

表1 一貫煎的活性成分

圖1 一貫煎成分-靶點網絡

圖2 一貫煎中藥成分-靶點-疾病網絡

2.4 基于中藥作用靶點的疾病預測

運用Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer工具分析一貫煎中藥成分-靶點-疾病網絡中疾病節點的網絡拓撲參數，根據中介中心度和節點度篩選出前十五位疾病（表2），其中癌癥是一貫煎顯著相關的疾病，有13個靶點，包括前列腺素G/H合成酶2、細胞分裂蛋白激酶2、尿激酶型纖溶酶原激活劑、表皮生長因子受體、轉錄因子AP-1、間質膠原酶等。檢索文獻可以找到關于一貫煎用于治療原發性肝癌[17]、肺癌[18,19]、乳腺癌[20,21]、炎癥[22-24]、焦慮癥[25]、抑郁癥[25-27]、帕金森病[28,29]以及非胰島素依賴型糖尿病[25]的報道，但尚未發現有關阿爾茲海默病、精神分裂癥、心血管疾病、哮喘、骨關節炎、心肌梗死、類風濕性關節炎、疼痛以及慢性阻塞性肺疾病等的報道。此外，我們的預測還發現一貫煎可用于治療可卡因等藥物依賴性癥狀，這將對藥物及毒品成癮的戒斷治療提供思路。

表2 一貫煎中藥成分-靶點-疾病網絡的拓撲參數和文獻來源

2.5 生物學過程及通路

通過DAVID在線軟件對一貫煎的生物學過程和通路進行富集分析，得到533個GO生物學過程，KEGG通路有120條，表3分別列舉了顯著富集的前15個生物學過程：藥物應答、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、積極調節轉錄，DNA模板、缺氧的細胞應答、缺氧應答、老化、雌二醇應答、血管收縮的正調節、細胞增殖的正調控、基因表達的正調控、凋亡過程的負調控、脂多糖、對有毒物質的反應、炎性反應以及腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路，和前15條KEGG通路：癌癥通路、乙型肝炎、前列腺癌、膀胱癌、TNF信號通路、胰腺癌、非小細胞肺癌、蛋白多糖與癌癥、恰加斯病（美洲錐蟲病）、結直腸癌、小細胞肺癌、HIF-1信號通路、利什曼病、子宮內膜癌以及甲狀腺激素信號通路。

3 討論

中藥復方以“多成分、多靶點、多途徑和多效應”為特征，被廣泛用于治療慢性復雜疾病，但在機理解釋，特別是在分子水平上系統地評價療效方面都具有挑戰性[30]。近年來，隨著網絡藥理學的發展，應用大量已經證實報道的數據及大通量檢測的信息，將已知中藥成分與疾病藥物靶點聯系起來，從而揭示中藥復方治療疾病的復雜關系[31]，對預測中藥復方治療的潛在疾病、闡述療效機制具有重要意義。

古方一貫煎主要用于治療各種疾病出現胸脘脅痛，吞酸吐苦，咽干口燥，舌紅少津等癥狀的肝腎陰虛之證，這是中醫臨床“異病同治”的依據。我們通過構建中藥成分-靶點-疾病網絡，進行了一貫煎“異病同治”網絡藥理學的分析，預測出一貫煎可能治療的疾病有癌癥、精神分裂癥、心血管疾病、焦慮癥、炎癥、抑郁癥、肝纖維化、肝硬化、卵巢早衰等。其中，一貫煎與癌癥、精神系統疾病、心血管系統疾病以及各種炎癥相關性較大。在癌癥中，乳腺癌、胰腺癌、肺癌節點度較高。這些大多被現代臨床和實驗研究所證實，能夠治療或緩解很多疾病或癥狀。其中，一貫煎治療乳腺癌更年期患者三個月后，潮熱盜汗、煩躁、抑郁等癥狀較治療前顯著減輕[19]。張等[24]發現一貫煎能明顯改善非小細胞肺癌NP方案化療后的肝腎功能和生活質量。治療伴焦慮抑郁癥狀的2型糖尿病兩個療程后，能顯著改善血糖水平和抑郁焦慮自評分[25]。治療帕金森綜合征三個月后治療組的Webster和UPDERS評分較對照組低，且有統計學差異[27]。

表3 顯著富集的15條GO生物學過程和KEGG通路

在實驗研究方面，通過對大鼠肝臟組織的膠原面積評比判定肝纖維化程度，發現與模型組相比一貫煎能夠顯著改善大鼠肝纖維化程度（P＜0.05）[32]。謝等[33]發現一貫煎能夠顯著提高H22荷瘤小鼠肝癌的抑瘤率并明顯減少血管內皮生長因子（VEGF）蛋白表達（P＜0.05）。研究還顯示一貫煎能明顯改善肝腎陰虛絕經前后的焦慮癥狀[34]。而且，通過測定大鼠血清III型前膠原（PCIII）、透明質酸酶（HA）、層粘連蛋白（LN）、IV型膠原（CIV）等肝纖維化指標發現一貫煎具有減輕肝組織病理損害、延緩肝纖維化進展[35]，并通過提高肝臟生物轉化功能、抑制肝臟炎癥反應、抑制肝細胞凋亡和肝星狀細胞活化、抑制肝竇內皮損傷、改善肝臟糖代謝及水鈉潴留等多種途徑，抑制CCl4誘導大鼠肝硬化形成[36]，還能夠提高2型糖尿病患者自我效能并降低胰島素抵抗[37]。另外，一貫煎可以顯著提高卵巢早衰大鼠血清中E2、ββ中衰水平，降低卵泡刺激素（FSH）水平（P均＜0.05），從而治療卵巢早衰[38]。

本研究通過對一貫煎的網絡藥理學預測，獲得了6個活性成分（松柏苷、阿托品、黃豆黃素、β胡蘿卜素、谷甾醇以及豆甾醇），為進一步探討這些天然化合物“異病同治”的效應提供了線索。而且，通過預測的活性成分和藥物靶點，從GO生物學過程和KEGG通路兩方面，進一步分析了一貫煎“異病同治”的機制。富集的生物學過程有藥物應答、RNA聚合酶II啟動子、轉錄的正調控、DNA模板、缺氧的細胞應答等。富集的通路有癌癥通路、乙型肝炎通路、腫瘤壞死因子信號通路等，提示了一貫煎“異病同治”的機制可能通過調控癌癥通路、乙型肝炎通路、腫瘤壞死因子信號通路以及缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等影響肝腎陰虛證型的癌癥、精神疾病、心血管疾病和炎癥性疾病等的生物學過程。而且，前期研究報道一貫煎抑制CCl4誘導大鼠肝細胞凋亡[36,39]，也證實了一貫煎能夠負調控凋亡過程的預測。

另外，還有關于一貫煎可以用于治療干燥綜合征皮膚病[40]、高血壓[41]、高脂血癥[42]以及婦科疾病[26,34,42,43]等的研究報道，但這些研究結果未在本次預測研究中體現出來，提示使用現有數據庫進行網絡藥理學預測的局限性。

4 結論

對一貫煎“異病同治”的網絡藥理學分析有助于識別其有效活性成分及作用靶點，解釋作用機制，為發現新的臨床適應病癥提供可能。但是，由于藥物成分、靶點、疾病數據庫的不完善，以及方藥劑量研究缺乏導致的以生物利用度和類藥性指數篩選活性成分的方法無法將化學成分在藥材中的含量考慮在內，中藥網絡藥理學的應用仍有不少缺陷，這些都需要我們不斷完善，并進行后續臨床試驗及實驗驗證。

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