番茄PIN基因家族的生物信息學分析及其表達模式

趙瑞瑞，申 琳，生吉萍

（1.清華大學生命科學學院，北京 100084；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.中國人民大學農業與農村發展學院，北京 100872）

番茄PIN基因家族的生物信息學分析及其表達模式

趙瑞瑞1,2，申 琳2，生吉萍3,*

（1.清華大學生命科學學院，北京 100084；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.中國人民大學農業與農村發展學院，北京 100872）

PIN蛋白是生長素輸出蛋白，具有多個跨膜結構域，能夠介導生長素在整個植物體內的流動。番茄作為一種具有重要經濟價值的果蔬，對其生長發育調控的研究具有重要的意義。研究表明，PIN蛋白對植物果實的生長發育起著重要的調控作用。本研究通過生物信息學的方法對番茄PIN基因組中10 個SlPINs的核酸和氨基酸序列進行分析，構建番茄SlPINs的進化樹，并分析番茄SlPINs在不同組織和果實生長發育過程中的表達量變化，為進一步研究SlPINs的生物學功能提供理論依據。

番茄果實；PIN基因；生物信息學分析；表達模式

生長素協調細胞的分裂和增殖分化，進而影響植物的生長發育。因此，生長素的時空分布調控對器官形成、胚胎形成、根的分生區生長及莖的生長具有重要的意義[1]。生長素控制果實發育的多個過程，包括果實形成、生長、成熟和脫落[2]。子房中生長素含量的異常增加或者破壞生長素的運輸會影響受精作用，導致出現單性結實的果實[3-4]。通過下調生長素反應調節因子如Aux/IAAs或者生長素反應因子ARFs也會產生單性結實[5-7]。生長素的極性運輸是調節生長素分布的重要機制，主要由控制生長素輸出和輸入的PIN蛋白和AUX/LAX蛋白介導[1]。PIN蛋白和AUX/LAX蛋白在細胞和組織間的非對稱分布產生了生長素梯度和生長素的定性流動[8-10]。

PIN蛋白存在于所有陸生植物中，甚至在蘚類中也存在PIN蛋白，目前已經從克倫藻屬和雙星藻中鑒定到PIN基因[11]。擬南芥中生長素的運輸和PIN蛋白的功能已得到充分的研究報道[12]。擬南芥PIN蛋白為跨膜蛋白，具有兩個疏水區和一個中央親水環，可直接參與生長素梯度的形成[10]。擬南芥PIN蛋白對細胞內和細胞間生長素的定向運輸起重要的作用[12-17]，參與根系發育過程中生長素、乙烯、細胞分裂素和獨角金內酯之間的相互作用[18]，并在胚胎發育、器官發生、組織分化和定性反應中存在功能冗余[11]。

Mounet等[19]研究發現，番茄SlPIN4基因沉默會產生果實單性結實現象，SlPIN4基因沉默影響生長素調控的果實生長發育相關基因的表達，使影響花蕾發育早期的生長素內穩態和ARF、Aux/IAA基因表達量發生變化，最終導致授精之前果實過早發育成熟，出現單性結實現象。Pattison等[20]對番茄10 個PIN基因在不同組織和生長階段的表達有較為詳細的報道，同時發現SlPIN4基因沉默的植株會出現葉片彎曲的現象。

本研究利用數據庫中番茄SlPINs的序列信息，通過生物信息學的方法系統研究番茄SlPINs家族的序列信息，包括SlPINs所編碼氨基酸的特性、SlPINs的系統進化樹以及SlPINs在不同組織和果實生長發育過程中的表達模式等，目的在于為進一步研究SlPINs的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物中PIN家族基因序列的獲得

番茄、紫花苜蓿、擬南芥、水稻和玉米5 種植物共53 個PIN家族成員的CDs序列、基因組序列和氨基酸序列信息來自NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫。

1.2 方法

1.2.1 番茄SlPINs的基本特征分析

利用ExPASy（http://www.expasy.org/tools）中的ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析SlPINs的分子質量、理論等電點、不穩定系數、親水性指數和脂溶指數，利用PSORT（http://www.psort.org/）分析亞細胞定位，利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）分析跨膜結構域，利用SOPMA（http:// npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma. html）進行蛋白質二級結構預測。

1.2.2 番茄SlPINs的進化樹分析

利用Clustal X軟件對5 種植物53 個PIN氨基酸序列進行多重比對，使用MEGA 4.0軟件分析比對結果，并用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，用重復1 000 次的bootstrap進行檢驗。

1.2.3 番茄SlPINs的表達量分析

番茄SlPINs在不同組織和果實生長發育不同時期的表達量數據來自番茄轉錄組數據庫（http://bar.utoronto.ca），并作圖。

2 結果與分析

2.1 番茄PIN基因的基本特征分析

在NCBI數據庫中共檢索到10 條番茄PIN基因序列（表1），分布在9 條染色體上，其中10號染色體上有SlPIN7和SlPIN9兩個PIN基因。番茄PIN基因編碼氨基酸長度在358～653 個氨基酸之間，其中編碼氨基酸長度在300～400 個氨基酸的有3 個；氨基酸長度在500～600 個氨基酸之間的有3 個；氨基酸長度在600～700 個氨基酸之間的有4 個。編碼氨基酸最長的是SlPIN4，其分子質量為71.2 kD，編碼氨基酸最短的是SlPIN10，其分子質量為38.41 kD。10 個PIN蛋白的理論等電點在6.98～9.19之間，只有SlPIN4和SlPIN10的理論等電點分別為6.98和6.99，其他PIN蛋白均為堿性氨基酸。根據PIN的不穩定系數發現，大部分PIN蛋白為穩定蛋白（不穩定系數小于40），只有SlPIN2和SlPIN4所編碼的蛋白為不穩定蛋白（不穩定系數大于40）。親水性指數表明，SlPIN5、SlPIN8和SlPIN10編碼的蛋白是疏水性蛋白，其脂溶指數也都大于100，其余親水性指數介于-0.5～+0.5之間為兩性蛋白。擬南芥PIN蛋白主要分布在細胞質膜和內質網膜，而番茄SlPIN5和SlPIN6編碼的蛋白質定位于細胞質膜和內質網膜上，其余均定位于細胞質膜上。

表1 番茄PIN 基因家族成員信息Table1 Information about members of the PIN gene family in Solanum lycopersicum

2.2 番茄PIN的基因結構和蛋白結構分析

根據NCBI數據庫中基因組信息，分析了番茄SlPINs家族成員的基因結構，如圖1所示，番茄SlPINs的進化樹分為2 個分支，SlPIN5和SlPIN10處于一個分支，其余SlPINs基因處于一個分支。SlPIN5和SlPIN10具有5 個外顯子和4 個內含子，在SlPIN1所在的分支中SlPIN6和SlPIN8具有7 個外顯子和6 個內含子，其余SlPINs基因都具有6 個外顯子和5 個內含子，SlPIN1、SlPIN9和SlPIN7進化關系最近，SlPIN3和SlPIN4進化關系最近。

圖1 番茄SlPINs 的進化樹和基因組結構圖Fig.1 Phylogenetic relationships and gene structures of SlPINs

圖2 番茄SlPINs 編碼蛋白質的跨膜結構特征預測圖Fig.2 Predicted protein prof i les of SlPINs gene family member transporters from tomato

PIN家族蛋白結構的特點是含有兩端兩個疏水區和一個中間親水區，每個疏水區由5 個跨膜折疊組成。番茄SlPINs所編碼的蛋白具有典型的N端跨膜結構域-中間胞質區-C端跨膜區結構域特征（圖2），中間胞質區的長度區別很大，其中SlPIN5、SlPIN8和SlPIN10編碼蛋白的胞質區長度大約為50 個氨基酸，而其余SlPINs編碼的蛋白胞質區長度大都在250～350 個氨基酸之間。

表2 番茄PIN蛋白家族成員的二級結構分析Table2 Secondary structures of members of the PIN protein family in Solanum lycopersicum

如表2所示，番茄SlPINs編碼的蛋白質由α-螺旋、延伸鏈、無規卷曲和β-轉角組成，其中α-螺旋和無規卷曲占比較高，除了SlPIN5、SlPIN8和SlPIN10編碼蛋白質的無規卷曲比α-螺旋的占比低外，其他SlPINs編碼蛋白質的無規卷曲占比均大于α-螺旋。

2.3 番茄PIN家族的進化分析

圖3 番茄SlPINs蛋白的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic relationships of the tomato PIN auxin transporters

利用MEGA 4的鄰接法構建了番茄、紫花苜蓿、擬南芥、水稻和玉米5 種植物共53 個PIN蛋白的進化樹（圖3），番茄SlPINs蛋白與擬南芥AtPINs、紫花苜蓿MtPINs進化關系最為接近，而玉米ZmPINs和水稻OsPINs的進化關系最接近。番茄SlPIN1、2、3、4、6、8分別與擬南芥AtPINs對應。由于擬南芥和紫花苜蓿沒有PIN10、SlPIN5和SlPIN10處于同一個染色體上，并且基因組結構相似，所以SlPIN10可能是通過基因組復制產生的。

2.4 番茄PIN基因的表達量變化

圖4 番茄不同組織中SlPINs基因的表達量變化Fig.4 Tissue-specific expression profiles of SlPINs genes

如圖4所示，根據番茄基因表達數據庫分析番茄SlPINs在不同組織和發育階段的表達發現，SlPIN1在花、葉、根和果實中都表達，在1 cm果實中表達量最高，AtPIN1也在各個組織中表達[21]；SlPIN2在根中有特異的表達，與AtPIN2特異性的在根中表達相同[22]；SlPIN3的表達主要集中在花器官中，在葉、根和果實中也有一定水平的表達，而AtPIN3主要在根分生組織和幼芽中表達[23]；SlPIN4在花、葉、根和果實中都有較高水平的表達，而擬南芥AtPIN4主要在根中表達，并在胚胎的極性建成時大量表達[24]；SlPIN5在花蕾和根中特異地表達，在根中表達量最高，研究表明，過表達AtPIN5的轉基因植株植株矮小、分枝較多，出現根和下胚軸生長缺陷及葉片細長皺縮[15]；SlPIN6主要在1 cm和2 cm果實中表達；SlPIN7、SlPIN8在各組織中表達量較低，但SlPIN8在1 cm果實中表達量最高，而AtPIN8在花藥中特異表達，調控花粉的發育[14]；SlPIN9在花、根和未成熟果實中表達量高，在根中表達量最高；SlPIN10特異性的在根中表達。本研究預測的SlPINs表達情況與Pattison等[20]的實驗結果非常類似，這為研究SlPINs對生長發育的調控機制增加了新的依據。

分析SlPINs在果實中的表達情況，隨著果實的不斷生長，SlPIN1、SlPIN4、SlPIN6、SlPIN8的表達量不斷降低，到果實完全成熟時SlPINs的表達量降至極低的水平，推測PIN蛋白調控的生長素在果實生長過程中起著非常重要的作用，當果實生長到一定大小時，PIN基因的表達量降低，因而生長素的作用減弱，推測生長素與乙烯之間可能存在相互抑制的關系。

3 結 論

PIN蛋白作為一種生長素輸出載體在植物尤其是在果實的生長發育過程中起著重要的作用。番茄的基因組中共有10 個PIN基因，對其基因表達模式的分析發現SlPINs主要分布在根和花器官中。SlPIN4在果實生長的初期（2 cm）有較高水平的表達，Mounet等[19]的研究也證明番茄SlPIN4基因沉默會導致果實的單性結實，進一步說明番茄SlPINs在果實生長發育中起著重要的作用。SlPIN1、SlPIN6、SlPIN8隨著果實的的不斷長大其表達量下降，推測SlPIN1、SlPIN6、SlPIN8也對果實的生長發育起重要作用，但目前對SlPIN1、SlPIN6、SlPIN8在果實中的功能還缺少實驗證據。因而關于番茄SlPINs在果實生長發育中的作用機制還有待進一步深入，SlPINs在果實生長發育中作用機制的研究將成為重要的研究內容。

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Bioinformatic Analysis of the PIN Gene Family in Tomato and Its Expression Pattern

ZHAO Ruirui1,2, SHEN Lin2, SHENG Jiping3,*
(1. School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 3. School of Agricultural Economics and Rural Development, Renmin University of China, Beijing 100872, China)

PIN-FORMED (PIN) proteins work as auxin eff l ux proteins with multiple transmembrane domains and mediate auxin fl ow throughout the plant. As tomato is an important cash crop, studies aimed to regulate its growth and development are of great significance. Studies have shown that PIN proteins play an important role in regulating the growth and development of fruits. In this study, we predicted the characteristics of ten tomato PIN members by using on-line software, constructed a phylogenetic tree for SlPINs, and analyzed expression changes of SlPINs in different tissues and during fruit growth and development. This study will provide a basis for future study on the biological functions of SlPINs.

tomato fruit; PIN gene; bioinformatic analysis; expression pattern

10.7506/spkx1002-6630-201704001

TS255.3

A

1002-6630（2017）04-0001-05

趙瑞瑞, 申琳, 生吉萍. 番茄PIN基因家族的生物信息學分析及其表達模式[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 1-5. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704001. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Ruirui, SHEN Lin, SHENG Jiping. Bioinformatic analysis of the PIN gene family in tomato and its expression pattern[J]. Food Science, 2017, 38(4): 1-5. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704001. http://www.spkx.net.cn

2016-04-17

國家自然科學基金面上項目（31371847；31272215）；國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2013CB127106）

趙瑞瑞（1984—），女，博士，研究方向為植物生理與分子生物學。E-mail：zhaorui1012@gmail.com

*通信作者：生吉萍（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品科學與食品安全管理。E-mail：shengjiping@126.com