基于尿嘧啶磷酸核糖轉移酶為負向篩選標記的生酮古龍酸桿菌基因組無痕修飾系統的構建

陸 浩，李天明，劉金雷，杜紅燕，王北辰，馮惠勇,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.威斯康星大學農業與生命學院，威斯康星 麥迪遜 53706）

基于尿嘧啶磷酸核糖轉移酶為負向篩選標記的生酮古龍酸桿菌基因組無痕修飾系統的構建

陸 浩1，李天明1，劉金雷1，杜紅燕1，王北辰2，馮惠勇1,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.威斯康星大學農業與生命學院，威斯康星 麥迪遜 53706）

通過構建尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因（upp）敲除打靶質粒，采用同源重組的方法獲得了生酮古龍酸桿菌（Ketogulonigenium vulgare）的upp基因缺失突變株K. vulgare Δupp，可作為基因組無痕修飾系統底盤細胞的upp基因表達載體，轉化突變株K. vulgare Δupp，獲得upp基因回補菌株PBB-upp，并驗證了upp作為負向篩選標記的可行性。實驗結果表明：突變株Δupp在1 mg/mL的5-氟尿嘧啶培養基上可生長，野生型和回補菌株PBB-upp不能生長，3株菌對5-氟尿嘧啶的抗性存在顯著差異，說明可以將upp基因作為負向篩選標記，與正向篩選標記相結合，在upp基因缺失的底盤細胞基礎上通過兩次同源重組，實現基因組的無痕修飾與改造。

生酮古龍酸桿菌；負向篩選標記；無痕改造；5-氟尿嘧啶

VC又名L-抗壞血酸，是人體必需的水溶性維生素之一?！皟刹桨l酵法”是目前VC的主要工業化生產方式[1-3]。生酮古龍酸桿菌（Ketogulonigenium vulgare）是目前VC兩步發酵工藝的重要生產菌，主要與芽孢桿菌等伴生菌完成糖酸轉化[4]。優良的菌種對于提高VC產率和經濟效益具有重要意義。

隨著分子生物學的發展及K. vulgare全基因組的測序完成[5-6]，利用代謝工程技術進行菌種改造正成為VC生產菌育種的主要手段。目前采用的基因敲除、基因敲入及點突變修飾等基因組改造技術中，多采用的是抗性篩選標記，存在一些弊端：被改造菌株可被使用的抗生素數量有限；多基因改造會因抗性標記的疊加使用影響目的菌的正常生長；抗性基因本身是外源基因，并不是宿主菌生長所必需，在食品行業產品使用中受到限制等[7-9]。所以，迫切需要研發K. vulgare基因組的無痕改造技術，以克服傳統的基因組改造技術中“疤痕”的存在和篩選標記不能反復使用的不足，實現多個基因的連續敲除，最終獲得VC高產優良菌種。

K. vulgare中存在upp基因，可編碼尿嘧啶磷酸核糖轉移酶（uracil phosphoribosyl transferase，UPRT），使細胞不能合成尿嘧啶，只能利用胞外尿嘧啶。5-氟尿嘧啶是胸腺嘧啶類似物，也能作為UPRT的底物被轉化成胸苷酸合成酶的強烈抑制劑，即5-氟單磷酸脫氧尿嘧啶（5-f l uoro-2’-deoxyuridine-5’-monophosphate，5-F-dUMP），5-F-d U M P的存在會導致宿主細胞死亡[10-11]。而upp基因缺失后菌體不能利用5-氟尿嘧啶產生毒性，可在含5-氟尿嘧啶的培養基中生長，從而使第2次重組后失去抗性基因和upp基因的突變株得以篩選。因此，借助5-氟尿嘧啶的毒性，UPRT可作為負向篩選標記使用。本實驗利用同源重組，敲除了染色體上UPRT的全長基因upp，構建得到底盤細胞K. vulgare Δupp突變株，經過upp基因回補實驗，驗證了UPRT作為負向篩選標記使用的可行性。在此底盤細胞的基礎上可以將upp基因作為負向篩選標記，進行基因的無痕敲入、敲除及修飾，克服了使用抗生素篩選標記的缺陷，為實現K. vulgare基因組無痕修飾，獲得具有高產優良性狀的優勢遺傳資源提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和載體

表1 本研究中使用的菌株與質粒Table1 Strains and plasmids used in this research

1.1.2 培養基

K. vulgare培養基（含卡那霉素）：葡萄糖20.0 g/L、玉米漿10.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、硫酸銨4.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、卡那霉素50 μg/mL、瓊脂20.0 g/L，pH 6.4～6.7。

LB培養基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0。

K. vulgare固體培養基：山梨醇20.0 g/L、玉米漿5.0 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸二氫銨0.5 g/L、硫酸銨2.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH 6.4～6.7。

K. vulgare篩選培養基：蔗糖100.0 g/L、山梨醇20.0 g/L、玉米漿5.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、磷酸二氫銨0.5 g/L、硫酸銨2.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣0.1 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH 6.4～6.7。

1.1.3 試劑

ExTaq聚合酶、限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ寶生物工程（大連）有限公司；HiFi DNA聚合酶北京全式金生物技術有限公司；T4 DNA連接酶 NEB（北京）有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素 上海生工生物工程有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-gal） 美國Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 鼎國生物工程公司；5-氟尿嘧啶 上海譜振生物科技有限公司；DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；全自動凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機 美國Thermo公司；酶標儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 K. vulgare對5-氟尿嘧啶的敏感性測定

5-氟尿嘧啶對K. vulgare野生型有一定毒性，會抑制其生長，當5-氟尿嘧啶質量濃度達到一定值時會使細胞死亡；為了確定其對K. vulgare生長抑制的最低質量濃度，在含不同質量濃度的5-氟尿嘧啶液體培養基和固體培養基中對野生型K. vulgare進行培養。根據文獻[12]設定測試的5-氟尿嘧啶最高質量濃度為2 mg/mL，隨后通過二倍稀釋法逐步降低5-氟尿嘧啶的質量濃度，選用4 個質量濃度梯度，分別為0、0.5、1.0、2.0 mg/mL。為保證接種量一致，接種前用無菌0.9% NaCl溶液稀釋調整菌懸液的OD600nm為0.7，4 個5-氟尿嘧啶質量濃度各接種菌液10 μL。液體培養基放置在30 ℃條件下，180 r/min搖床中振蕩培養，每隔6 h觀察記錄菌株生長情況。固體平板用相同的接種環接種后放置在30 ℃恒溫培養箱中，倒置培養，24 h后觀察記錄菌株生長情況。

1.3.2 敲除upp基因打靶載體的構建

以K. vulgare基因組DNA、pEASY質粒為模板，利用PCR擴增出upp基因的上下游同源臂和卡那抗性基因片段，將3 個片段等物質的量比例混合后作為模板，通過重疊PCR獲得目的條帶，PCR產物純化后與pMD18-T載體相連，轉化進大腸桿菌Trans 5α感受態細胞內，經菌落PCR驗證，獲得打靶載體pMD18-T-xqupp，送由上海生工股份有限公司測序。

1.3.3 K. vulgare Δupp菌株的構建

圖1 利用同源雙交換進行基因敲除原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of gene deletion based on homologous double switch

K. vulgare中upp基因的敲除是通過2 次同源重組來實現的（圖1）。將重組質粒pMD18-T-xqupp電擊轉化至野生型K. vulgare感受態細胞中，通過第1次同源重組卡那霉素抗性基因被整合到染色體上，利用卡那霉素固體平板篩選出發生重組的菌株，將發生第1次重組的菌株在液體培養基中培養后會自發產生第2次同源重組，此時可能出現upp基因缺失菌株和缺失基因恢復菌株，將菌液稀釋涂布于含5-氟尿嘧啶的固體平板上，長出轉化子后分別挑取后轉接至含5-氟尿嘧啶和卡那霉素的平板上，5-氟尿嘧啶培養基上生長而卡那霉素培養基上不能生長的菌株則為目的菌株。

將得到的pMD18-T-xqupp打靶載體通過電轉化（電擊條件為：2.5 kV/cm電壓、250 Ω電阻、25 μF電容、2 mm電擊杯）于K. vulgare野生型感受態細胞中，30 ℃條件下培養48 h，挑取轉化子，利用菌落PCR對轉化子進行驗證，從而獲得upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp。

1.3.4 upp基因回補菌株的構建

以K. vulgare基因組為模板，利用PCR擴增出upp基因，將PCR片段回收后與空質粒pBBRIMCS-5分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收目的片段后通過T4連接酶16 ℃連接過夜，轉化至大腸桿菌Trans 5α感受態細胞，利用菌落PCR驗證出構建成功的upp基因回補質粒pBBR1MCS-5-upp。將構建成功的回補質粒pBBR1MCS-5-upp電轉化到已獲得的upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp的感受態細胞中，通過PCR驗證獲得upp基因回補菌株K. vulgare Δupp/upp。

1.3.5 工程菌生理活性驗證

利用1.3.1節方法，分別在含有不同質量濃度5-氟尿嘧啶的液體培養基和固體培養基中培養upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp和upp基因回補菌株K. vulgare Δupp/upp，定時觀測記錄菌株生長情況，研究工程菌株對5-氟尿嘧啶的耐受性。

2 結果與分析

2.1 K. vulgare對5-氟尿嘧啶的敏感性分析

圖2 K. vulgare對5-氟尿嘧啶的敏感性結果Fig.2 5-Fluorouracil sensitivity of K. vulgare cultivated in solid (a) and liquid (b) media

如圖2所示，當5-氟尿嘧啶質量濃度為1 mg/mL時，固體培養基和液體培養基中培養的野生型K. vulgare不能正常生長，因此確定5-氟尿嘧啶對K. vulgare生長起到抑制作用的最低質量濃度為1 mg/mL。

2.2 upp基因缺失菌株的獲得

2.2.1 打靶載體的構建及驗證

通過融合PCR技術，構建帶有upp基因的上下游同源臂和卡那抗性基因片段的重組質粒pMD18-T-xqupp。經PCR驗證，條帶與設計條帶大小一致，結果如圖3。

圖3 pMD18-T-xqupp質粒PCR驗證Fig.3 PCR identifi cation of plasmid pMD18-T-xqupp

2.2.2 upp基因缺失菌株的篩選

圖4 K. vulgareΔupp突變株菌落PCR驗證Fig.4 Validation of K. vulgare Δ upp deletion mutant

將打靶質粒轉化K. vulgare野生型感受態細胞，得到具有卡那抗性的陽性轉化子，利用菌落PCR擴增upp基因，結果如圖4所示，野生型K. vulgare在目的位置能夠擴增出條帶，而工程菌株在目的位置沒有條帶，從而獲得了upp基因缺失的工程菌K. vulgare Δupp。

2.3 upp基因回補菌株的構建

構建upp基因回補質粒pBBR1MCS-5-upp，轉化大腸桿菌Trans 5α，經酶切驗證，如圖5B所示，質粒大小4 800 bp，片段大小630 bp，與理論值一致，說明質粒構建成功。將質粒pBBR1MCS-5-upp經電轉化至K. vulgare Δupp菌株中，得到轉化子K. vulgare Δupp/upp，分別對upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp和轉化子K. vulgare Δupp/upp進行PCR驗證，如圖5C所示，菌株K. vulgare Δupp不能擴增出upp基因，而K. vulgare Δupp/upp能夠擴增upp基因，說明K. vulgare Δupp/upp菌株中回補了upp基因。

圖5 upp 基因的PCR擴增（A）、pBBR1MCS-5-upp 質粒酶切（B）及的鑒定（C）Fig.5 PCR Amplif i cation of upp gene (A), enzyme digestion identif i cation of pBBR1MCS-5-upp plasmid (B) and identif i cation of K. vulgare Δupp/upp (C) K. vulgareΔupp/upp

2.4 工程菌株生理活性驗證

根據UPRT的催化功能和5-氟尿嘧啶的毒性原理，upp基因缺失菌株能在含5-氟尿嘧啶的篩選培養基上生長，而野生型菌株和回補upp基因的工程菌株不能夠生長。故將K. vulgare、K. vulgare Δupp和K. vulgare Δupp/upp分別接種在含0、1 mg/mL的5-氟尿嘧啶固體和液體培養基中培養，觀察菌體的生長情況，結果如圖6。驗證結果表明upp基因缺失菌株K. vulgare Δupp在含5-氟尿嘧啶的培養基上能夠正常生長，而upp基因回補菌株K. vulgare Δupp/upp與野生型菌株K. vulgare一樣，均在不能在含1 mg/mL 5-氟尿嘧啶的培養基上生長，這3 株菌對5-氟尿嘧啶的抗性存在顯著差異，說明可以將upp基因作為負向篩選標記，與正向篩選標記相結合，在upp基因缺失底盤細胞基礎上通過兩次同源重組，實現基因組的無痕修飾與改造。

圖6 5-氟尿嘧啶對基因工程菌生長狀況的影響Fig.6 Effects of 5-f l uorouracil of the growth of mutant strains

3 討 論

利用負向篩選標記實現基因組無痕修飾改造方面的研究已取得一定成果。例如Karlinsey[13]于2007年利用Bochner-Maloy培養基與抗性篩選標記tetAR相結合，完成對沙門氏菌（Salmonella）的基因無痕敲除。后Cox[14]、Gerlach[15]等也均采用無痕敲除方法完成對沙門菌基因組的無痕修飾改造。Mizoguchi[16]、Yang Junjie[17]等選用sacB基因作為負向篩選標記，成功構建大腸桿菌（Escherichia coli）的基因無痕敲除、插入系統。2011年劉霞等[18]基于同源重組技術用sacB重組載體成功敲除副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的opaR基因。同年Kato等[19]實現了sarS基因在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的無痕敲除。但對于K. vulgare的此類研究還處于空白。

UPRT廣泛存在于原核生物、某些低等真核生物細胞中，其作為負向篩選標記還鮮見相關報道。K. vulgare中的upp基因全長630 bp，編碼尿嘧啶生成UPRT，使細胞合成尿嘧啶。5-氟尿嘧啶是胸腺嘧啶類似物也能作為UPRT的底物被轉化成胸苷酸合成酶的強烈抑制劑，即5-F-dUMP，5-F-dUMP的存在會抑制胸腺嘧啶合成酶活性，導致宿主細胞死亡。利用這一特性，尿嘧啶生成UPRT的表達與否，直接影響菌株對5-氟尿嘧啶的抗性，影響菌株的存活與否。利用這種生長差異，借助5-氟尿嘧啶的篩選培養基，就可以對重組菌進行篩選。

本實驗通過重疊PCR[20-21]、TA克隆[22]、轉化[23-25]等方法獲得打靶質粒。制備宿主菌感受態細胞，將打靶載體電轉至宿主菌感受態中，經2 次同源重組篩選出了K. vulgare Δupp突變株，生理驗證該菌株能在含1 mg/mL 5-氟尿嘧啶培養基上生長，本實驗獲得的upp基因缺失突變株及其對5-氟尿嘧啶的抗性性狀研究，對于無痕遺傳修飾技術發展具有重要的參考價值。

圖7 利用K. vulgareΔupp進行基因無痕敲除原理圖Fig.7 Schematic of scarless gene knockout based on K. vulgare Δupp

為了驗證upp基因作為負向篩選標記的可行性，本實驗在upp缺失菌株基礎上，回補了upp基因，該菌株在1 mg/mL 5-氟尿嘧啶培養基上不生長，說明可實現在upp缺失的底盤細胞中利用一次交換2 次重組進行基因無痕敲除（圖7）。打靶質粒的構建包括被敲除基因的上游同源臂、抗性篩選標記基因、可表達的upp基因和被敲除基因的下游同源臂，第1次重組通過抗性篩選后，將得到的轉化子在無抗生素的培養基上孵育后，再涂到含有5-氟尿嘧啶的篩選平板上，只有實現二次重組的轉化子，由于去除了抗性基因和upp基因得以存活，得到的陽性轉化子既敲除了目標基因又沒有抗性基因殘留，以此建立了K. vulgare基因組無痕修飾改造系統，這在國內外屬先進技術。本研究結果不僅為代謝工程改造K. vulgare獲得優良VC高產菌株提供了理論和技術支持，也為其他工業菌株的代謝工程改造提供了技術方法的借鑒。

[1] 周彬, 李怡, 劉耀平, 等. VC二步發酵中的微生物生態調控[J].應用生態學報, 2002, 13(11): 1452-1454. DOI:10.13287/j.1001-9332.2002.0336.

[2] 呂淑霞, 馮樹, 張忠澤, 等. VC二步發酵中伴生菌的作用機制[J].微生物學報, 2001, 28(5): 10-13. DOI:10.13344/j.microbiol. china.2001.05.003.

[3] 王虹. 維生素C兩步發酵中關鍵步驟的分子生物學研究[D]. 北京:中國人民解放軍軍事醫學科學院, 2005: 5-9.

[4] YANG F, JIA Q, XIONG Z, et al. Complete genome analysis of Ketogulonigeium sp. WB0104[J]. Chinese Science Bulletin, 2006, 51(8): 941-945. DOI:10.1007/s11434-006-0941-7.

[5] XIONG X, HAN S, WANG J, et al. Complete genome sequence of the bacterium Ketogulonicigenium vulgare Y25[J]. Journal of Bacteriology, 2011, 193(1): 315-316. DOI:10.1128/JB.01189-10.

[6] ZOU W, LIU L, ZHANG J, et al. Reconstruction and analysis of a genome-scale metabolic model of the vitamin C producing industrial strain Ketogulonicigenium vulgare WSH-001[J]. Journal of Biotechnology, 2012, 161(1): 42-48. DOI:10.1016/ j.jbiotec.2012.05.015.

[7] 楊奇. 大腸桿菌DH5α upp基因的敲除及其應用研究[D]. 南京: 南京理工大學, 2013: 4-10.

[8] BAILEY J E. Toward a science of metabolic engineering[J]. Science, 1991, 252: 1668-1675. DOI:10.1126/science.2047876.

[9] 胡逢雪, 丁銳, 崔震海, 等. 大腸桿菌基因無痕敲除技術及策略[J].生物技術通訊, 2013, 24(4): 552-557.

[10] HASEGAWA N, ABEIL M, YOKOYAMA K K, et al. Cyclophosphamide enhances antitumor efficacy of oncolytic adenovirus expressing uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) in immunocompetent Syrian hamsters[J]. International Journal of Cancer, 2013, 133: 1479-1488. DOI:10.1002/ijc.28132.

[11] ANDERSEN P S, SMITH J M, MYGIND B. Characterization of the upp gene encoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12[J]. Federation of European Biochemical Societies, 1992, 204(1): 51-56. DOI:10.1111/j.1432-1033.1992.tb16604.x.

[12] ISLAM S, HASSAN F, TUMURKHUU G, et al. 5-Fluorouracil prevents lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW 264.7 macrophage cells by inhibiting Akt-dependent nuclear factorkappa B activation[J]. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2007, 59(2): 227-233. DOI:10.1007/s00280-006-0261-2.

[13] KARLINSEY J E. lambda-Red genetic engineering in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]. Methods in Enzymology, 2007, 421: 199-209. DOI:10.1016/S0076-6879(06)21016-4.

[14] COX M M, LAYTON S L, JIANG T S, et al. Scarless and sitedirected mutagenesis in Salmonella enteritidis chromosome[J]. BMC Biotechnology, 2007, 7: 59. DOI:10.1186/1472-6750-7-59.

[15] GERLACH R G, J?CKEL D, H?LZER S U, et al. Rapid oligonucleotide-based recombineering of the chromosome of Salmonella enterica[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(6): 1575-1580. DOI:10.1128/AEM.02509-08.

[16] MIZOGUCHI H, TANAKA-MASUDA K, MORI H. A simple method for multiple modif i cation of the Escherichia coli K-12 chromosome[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2007, 71(12): 2905-2911. DOI:10.1271/bbb.70274.

[17] YANG J J, SUN B B, HUANG H, et al. High-efficiency scarless genetic modification in Escherichia coli by using lambda-red recombination and I-SceI cleavage[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(13): 3826-3834. DOI:10.1128/AEM.00313-14.

[18] 劉霞, 高鶴, 楊琳, 等. 副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及應用[J].中國實驗動物學報, 2011, 19(3): 188-192.

[19] KATO F, SUGAI M. A simple method of markerless gene deletion in Staphylococcus aureus[J]. Journal of Microbiological Methods, 2011, 87(1): 76-81. DOI:10.1016/j.mimet.2011.07.010.

[20] URBAN A, NEUKIRCHEN S, JAEGER K E. A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(11): 2227-2228. DOI:10.1093/nar/25.11.2227.

[21] 徐芳, 姚泉洪, 熊愛生, 等. 重疊延伸PCR技術及其在基因工程上的應用[J]. 分子植物育種, 2006, 4(5): 747-750.

[22] HOLTON T A, GRAHAM M W. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(5): 1156. DOI:10.1093/nar/19.5.1156.

[23] DOWER W J, MILLER J F, RAGSDALE C W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation[J]. Nucleic Acids Research, 1988, 16(13): 6127-6145. DOI:10.1093/ nar/16.13.6127.

[24] MANDEL M, HIGA A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection[J]. Journal of Molecular Biology, 1970, 53(1): 159-162. DOI:10.1016/0022-2836(70)90051-3.

[25] COHEN S N, CHANG A C Y, HSU L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1972, 69(8): 2110-2114.

Construction of a Marker-Free Deletion System Based on the Uracil Phosphoribosyl Transferase Gene as a Negative Selection Marker in Ketogulonigenium vulgare

LU Hao1, LI Tianming1, LIU Jinlei1, DU Hongyan1, WANG Beichen2, FENG Huiyong1,*
(1. College of Bioscience & Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. College of Agriculture and Life Science, University of Wisconsin, Madison 53706, USA)

By constructing the targeting vector of the uracil phosphoribosyl transferase gene (upp), the upp gene deletion mutant K. vulgare Δupp was obtained using homologous recombination. The mutant was selected as the chassis cell in seamlesss genome modification system. An upp gene expression vector was constructed and transformed into mutant K. vulgare Δupp. After the transformation, an upp gene reverse mutation strain named PBB-upp was obtained, and the feasibility of upp as a negative selectable marker was verified. The results showed that Δupp mutants rather than the wildtype and reverse PBB-upp strains could grow in a medium with 1 mg/mL 5-fluorouracil. Moreover, there were signif i cant differences among the three strains in terms of 5-f l uorouracil resistance, indicating that by combining the upp gene as a negative marker with a positive marker, double homologous recombinations could occur on the chassis cell without the upp gene. In this way, the modif i cation can be achieved without antibiotic marker in Ketogulonigenium vulgare.

Ketogulonigenium vulgare; negative selection marker; scarless gene alteration; 5-f l uorouracil

10.7506/spkx1002-6630-201704007

Q789

A

1002-6630（2017）04-0039-06

陸浩, 李天明, 劉金雷, 等. 基于尿嘧啶磷酸核糖轉移酶為負向篩選標記的生酮古龍酸桿菌基因組無痕修飾系統的構建[J].食品科學, 2017, 38(4): 39-44. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704007. http://www.spkx.net.cn

LU Hao, LI Tianming, LIU Jinlei, et al. Construction of a marker-free deletion system based on the uracil phosphoribosyl transferase gene as a negative selection marker in Ketogulonigenium vulgare[J]. Food Science, 2017, 38(4): 39-44. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704007. http://www.spkx.net.cn

2016-04-07

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2014AA022102）

陸浩（1991—），男，碩士研究生，研究方向為合成生物學與代謝工程。E-mail：840835694@qq.com

*通信作者：馮惠勇（1967—），女，教授，碩士，研究方向為合成生物學與代謝工程。E-mail：fenghuiyong@hotmail.com