草甘膦人工抗原的制備及兔源多抗的ELISA鑒定

王 晶，王 耀*，王方雨，鄧瑞廣，胡驍飛，余秋穎，郝俊芳，邢云瑞，侯玉澤

（1.河南省農業科學院 河南省動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南科技大學食品與生物工程學院，畜禽疫病診斷與食品安全檢測河南省工程實驗室，河南 洛陽 471023）

草甘膦人工抗原的制備及兔源多抗的ELISA鑒定

王 晶1,2，王 耀2,*，王方雨1,*，鄧瑞廣1，胡驍飛1，余秋穎1，郝俊芳1，邢云瑞1,2，侯玉澤2

（1.河南省農業科學院 河南省動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南科技大學食品與生物工程學院，畜禽疫病診斷與食品安全檢測河南省工程實驗室，河南 洛陽 471023）

采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）法和戊二醛（glutaraldehyde，GA）法，合成了草甘膦（N-(phosphonomethyl) glycine，PMG）人工抗原，通過免疫制備高敏感性、特異性的兔PMG多克隆抗血清并進行鑒定。將PMG分別與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）偶聯，合成免疫抗原PMG-BSA和包被抗原PMG-OVA。經紫外掃描、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，免疫新西蘭大白兔，制備多抗。利用間接酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法測定多抗效價，間接競爭ELISA方法測定血清的敏感性和特異性。結果表明，免疫的3 只兔血清效價均達1∶104以上，2號兔多抗效果最好，半數抑制濃度（IC50）為30.9 μg/mL，且具備良好的特異性。本實驗成功合成了PMG人工抗原，并制得了敏感性高、特異性好的兔多抗，為PMG的免疫學快速檢測方法的提供參考。

草甘膦；人工抗原；多抗；酶聯免疫吸附檢測

近年來草甘膦殘留引起人們的廣泛關注，目前用于草甘膦殘留檢測的主要方法為儀器分析方法，包括光譜法[1]、氣相色譜法[2]、高效液相色譜-串聯質譜法[3]、離子色譜法[4-5]、毛細管電泳法[6]以及流動注射化學發光法[7]等，這些方法存在儀器設備昂貴、操作人員專業要求高以及樣品前處理程序復雜等一系列弊端；而針對草甘膦（N-(phosphonomethyl) glycine，PMG）的簡便快速檢測方法發展迅速，主要是建立在免疫學反應基礎之上，這些免疫學檢測方法由于操作簡便、檢測成本低等優點而被廣泛應用。Clegg等[8]制備了兔抗PMG多克隆抗體，采用間接競爭酶聯免疫吸附反應檢測PMG，最低檢測限達7.6 μg/mL。Lee等[9]利用一個由雙抗原和DNA膠體金微粒為探針組成的三明治夾心免疫傳感器檢測PMG，檢測范圍為0.01～100 μg/mL。González-Martínez等[10]將抗PMG免疫血清與酶標PMG以及熒光檢測相結合，通過酶聯免疫吸附反應（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定PMG含量，最低檢測限達到21 ng/L。潘熙萍等[11]通過1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）法制備免疫原和包被原，對新西蘭大白兔進行免疫制備多克隆抗體，建立PMG間接競爭ELISA檢測方法，并應用于玉米粉和小麥粉中PMG的殘留檢測。

為了能夠獲得高質量的抗體，本實驗利用EDC法和戊二醛（glutaraldehyde，GA）法，將PMG與載體蛋白進行偶聯，并分別用紫外掃描、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠電泳方法對免疫原進行鑒定，經大白兔免疫后獲得針對PMG的兔源多抗且免疫學特性良好，本研究所制備的PMG人工抗原可應用于ELISA快速檢測方法的初步建立。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

潔凈級3 月齡雌性新西蘭大白兔，由河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室提供。

1.1.2 試劑

PMG（純度≥98%）、EDC、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國Thermo Scientific公司；GA 美國Sigma Aldrich公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 美國Pierce公司；羊抗兔酶標二抗（goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase，GaRIgGHRP） 華美生物工程有限公司；雙蒸水由動物免疫實驗室自制；常規試劑均為國產分析純。

1.1.3 溶液

2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid， MES，0.1 mol/L）緩沖液；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，0.01 mol/L）；PBST洗液（V（PBS）∶V（Tween20）=2×103∶1）；包被緩沖溶液（0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液）；封閉液（V（PBST）∶V（豬血清）＝20∶1）；TMB顯色液；終止液（2 mol/L H2SO4）。

1.1.4 儀器與設備

AE260電子天平 德國Mettler公司；HI9321酸度計意大利Hanna公司；恒溫磁力攪拌器 上海亞榮儀器廠；Nano Drop 1000微量紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher公司；JM-250電泳儀 大連捷邁科貿有限公司；凝膠成像系統及分析軟件 美國Syngene公司；3K-18高速冷凍離心機 德國Sigma公司；550型酶標儀 美國Bio-Rad公司；超純水儀 德國Millipore公司；電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成

1.2.1.1 EDC法合成人工抗原

[12-13]合成抗原，利用EDC法進行人工抗原的合成，碳二亞胺EDC是一種化學性質很活潑的試劑，能使氨基和羧基間脫水縮合而形成酰胺鍵。使PMG的羧基先與EDC反應，生成中間產物，然后再與BSA的氨基反應，形成偶聯產物。合成路線如圖1所示，首先，稱量PMG 10 mg，BSA 15 mg。將PMG用1 mL雙蒸水溶解后得到溶液A，用1.5 mL的0.1 mol/L MES溶解BSA得到溶液B，稱取30 mg的EDC和20 mg的NHS溶于1 mL MES溶液得到溶液C。將溶液C逐滴加入溶液A中反應5 min，使PMG得到充分活化，然后加入溶液B中。在室溫條件下，磁力攪拌2 h。在PBS中透析72 h，5 000 r/min離心5 min取上清液，即得免疫抗原PMG-EDC-BSA，-20 ℃保存備用。同法制得包被抗原PMG-EDC-OVA。

圖1 免疫原PMG-EDC-BSA合成示意圖Fig.1 Synthesis scheme for immunogen PMG-EDC-BSA

1.2.1.2 GA法合成人工抗原

GA是一種同型雙功能交聯劑，它的兩個醛基可分別與兩個氨基化合物的氨基形成Schiff堿（—N＝C—)，在兩個化合物之間插入一個五碳橋，合成路線如圖2所示。首先，稱量PMG 15 mg，BSA 12 mg。將PMG用1 mL雙蒸水溶解后得到溶液A，用1.5 mL的PBS溶液溶解BSA得到B溶液。將A溶液逐滴加入B溶液中，然后加入GA 24 μL，室溫避光磁力攪拌3 h。然后加入少量氰基硼氫化鈉粉末，繼續攪拌20 min后，取出溶液進行透析。在PBS中透析72 h，5 000 r/min離心5 min，取上清液，即得免疫抗原PMG-GA-BSA，-20 ℃保存備用。同法制得包被抗原PMG-GA-OVA。

圖2 免疫原PMG-GA-BSA合成示意圖Fig.2 Synthesis scheme for immunogen PMG-GA-BSA

1.2.2 人工抗原鑒定

1.2.2.1 紫外掃描鑒定

用PBS溶液配制BSA標準溶液，使其與免疫抗原的濃度相一致。用紫外-可見分光光度計掃描，在波長220～440 nm范圍內可得最大吸收峰及特征值的掃描圖。

1.2.2.2 SDS-PAGE鑒定

參照文獻[14]的方法，配制電泳所需濃縮膠和分離膠。由于分離蛋白分子質量相對較大，因此選擇濃縮膠（5%）、分離膠（10%），上樣量20 μL、濃縮膠電壓60 V，時間大約30 min。分離膠的電壓為100 V，直到完全結束為止。考馬斯亮藍染色3～4 h后，置于脫色液中脫色，更換3～4 次脫色液。對SDS-PAGE膠進行掃描照相，依據蛋白條帶位置差異來判斷偶聯效果。

1.2.3 免疫學方法制備兔多抗

將兩種免疫原溶解于無菌PBS溶液中，首次免疫使用弗式完全佐劑，加強免疫使用弗式不完全佐劑，用乳化器對其進行乳化，待溶液變成白色乳濁液后進行免疫。選取潔凈3 月齡新西蘭大白兔3 只，分別編號1號為PMG-EDC-BSA，2號和3號為PMG-GA-BSA，在頸部的皮下4點進行注射。免疫劑量為1 mL/只，蛋白含量為150 μg/只。每次免疫間隔時間為3 周，第3次免疫之后30 d，對大白兔進行耳緣靜脈采血。取血10 μL溶于990 μL生理鹽水中，5 000 r/min離心5 min，取出上清液，4℃保存待用。

1.2.4 多抗效價測定

采用間接ELISA方法對多抗進行效價進行檢測。取PMG-OVA包被好的聚苯乙烯板。第1步，用雙蒸水鋪底50 μL/孔（第1行不加），在第1行內加入兔血清100 μL/孔，從第1行內取出50 μL/孔，加入第2行，依次向下倍比到最后一行。由于要保持實驗中溶液體系一致，在倍比后的每孔中都加入50 μL雙蒸水。實驗中設計有空白對照組，室溫放置30 min，洗滌4 次；第2步，加入羊抗兔二抗，用PBST溶液1∶1 000倍稀釋，50 μL/孔，室溫放置30 min，洗滌4 次；第3步，加入TMB顯色液100 μL/孔，室溫反應10 min；最后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。用酶標儀進行讀數OD450nm。以待測孔OD450nm值不小于空白對照 OD450nm值的2.1 倍（P/N≥2.1），判定為陽性孔。

1.2.5 多抗半數抑制濃度的測定

將效價測定步驟的第一步中，倍比后的50 μL雙蒸水，替換為不同濃度的標準品。其他的實驗步驟同1.2.4節。

1.2.6 多抗交叉反應的測定

使用有機磷類農藥亞胺硫磷、毒死蜱、馬拉硫磷、敵敵畏，對硫磷以及載體蛋白BSA和OVA作為競爭物，利用間接競爭ELISA測定兔多抗對各競爭物的IC50。以兔多抗對PMG的IC50與各競爭物的IC50的百分比作為其交叉反應率（cross-reactivity，CR）。

2 結果與分析

2.1 人工抗原的鑒定結果

2.1.1 紫外掃描鑒定結果

圖3 BSA、PMG、PMG-EDC-BSA、PMG-GA-BSA紫外掃描圖譜Fig.3 UV absorption spectra of BSA, PMG, PMG-EDC-BSA and PMG-GA-BSA

如圖3可以看出，BSA在280 nm波長處有吸收峰。PMG-BSA偶聯后的紫外吸收峰與BSA相比發生了一定的位移，兩種偶聯物在波長310 nm和330 nm處均出現吸收峰，說明偶聯成功。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定結果

圖4 PMG-BSA的SDS-PAGE鑒定結果Fig.4 Identifi cation of PMG-BSA by SDS-PAGE

SDS-PAGE鑒定結果如圖4所示，BSA和免疫原PMGBSA的分子質量均在63～75 kD之間，但PMG-BSA的遷移距離小于未偶聯的BSA。經過對比可知，PMGBSA的分子質量較BSA有所增加，可初步說明人工抗原偶聯成功。

2.2 多抗的鑒定結果

2.2.1 間接ELISA效價測定結果

表1 間接ELISA測定多抗效價Table1 Titer of antisera detected by indirect ELISA

由表1可知，免疫3 只兔子效價均達到1∶1×104以上，其中1號兔子的血清效價最高，可達到1∶5.12×104，即證明免疫原注射得到了較好的免疫效果，同時ELISA結果也表明實驗合成的包被原也具有良好的效果。

2.2.2 多抗的敏感性鑒定結果

表2 多抗敏感性的間接競爭ELISA測定的OD450nm值Table2 Sensitivity of polyclonal antiserum detected by indirect competitive ELISA

圖5 多抗對PMG的間接競爭ELISA抑制曲線Fig.5 Inhibitory curve for pAb against PMG detected by indirect competitive ELISA

由表2可知，3 只大白兔的多抗均對PMG農藥有抑制，抑制曲線如圖5所示，其中1號大白兔的IC50為43.4 μg/mL，2號大白兔的IC50為30.9 μg/mL，3號大白兔的IC50為41.1 μg/mL。表明2號兔子的多抗對PMG農藥的敏感性較強。

2.2.3 多抗的特異性鑒定結果

實驗中用1號兔子的多抗與有機磷類農藥進行交叉反應。由表3可知，多抗與有機磷類農藥亞胺硫磷、毒死蜱、馬拉硫磷、敵敵畏，對硫磷以及載體蛋白BSA和OVA的CR低，具有很好的特異性。

表3 多抗與其他有機磷類農藥的交叉反應Table3 Cross-reactivity of rabbit antiserum with other organophosphorus pesticides

3 討 論

3.1 抗原的設計合成

針對半抗原的設計、修飾、載體的選擇、半抗原與載體的偶聯、人工抗原的鑒定等方面進行全面的設計與分析[15]，才能得到良好的人工抗原，以刺激動物產生針對半抗原的特異性抗體。因此，本實驗設了兩種不同的方法進行人工抗原的偶聯，針對不同的偶聯方法，要選擇合適的偶聯條件，還應注意偶聯時的加入順序，避免蛋白發生自身偶聯。

3.2 人工抗原的鑒定

在合成人工抗原后，通常先進行物理化學方法的初步鑒定，常用的小分子人工抗原鑒定方法有可見-紫外分光光度法[16-17]、SDS-PAGE電泳[18]、示蹤同位素法[19]、三硝基苯磺酸法[20]、電噴霧離子化質譜法[21]、基質輔助激光解吸離子化質譜法[22]等。本實驗利用了前兩種方法對偶聯效果進行了鑒定，方法簡單易操作、可行性高，且兩種方法的鑒定結果相吻合。

3.3 免疫劑量的選擇

根據以上免疫學特性鑒定結果可知，所合成的免疫原經免疫大白兔之后，獲得了敏感性好，特異性強的多抗。免疫劑量對多抗的效價有很重要的作用，因此免疫的劑量選擇也是關鍵問題。根據前人對于免疫劑量的探索，本實驗選擇的免疫劑量為1 mL/只，蛋白含量為150 μg/只。

3.4 合成方法對多抗的影響

免疫大白兔后得到的多抗，其效價有一定差異，分析其原因大致為兩種。其一，免疫前所設計免疫劑量相同，但免疫時由于人工注射，可能存在一定的誤差；其二，免疫動物存在個體差異，導致抗體的效價差異。EDC法的操作相對簡單，所需要的條件穩定，得到兔源多抗的效價較高。而GA法，需要避光反應，且反應所需藥品毒性較強，合成的人工抗原穩定性較差。

4 結 論

本實驗通過EDC法和GA法成功合成了PMG人工抗原，并免疫新西蘭大白兔得到了高效、敏感、特異的兔源多抗，對PMG的免疫學檢測體系進行了初步的探索。通過對比表明，兩種偶聯方法都可行。本實驗成功制備兔源多抗，為今后進一步篩選鼠源的單抗提供參考依據。

參考文獻：

[1] 張莉, 陳亮, 劉菲. 快速分光光度法同步測定地下水中赤霉素和草甘膦的相互影響[J]. 光譜學與光譜分析, 2015(4): 966-970. DOI:10.3964/j.issn.1000-0593(2015)04-0966-05.

[2] 王天玉, 武秀停, 趙靜, 等. 固相萃取-氣相色譜法測定薏苡仁、白茯苓和山藥中的草甘膦殘留[J]. 分析科學學報, 2014(1): 63-66.

[3] 諸力, 陳紅平, 周蘇娟, 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法測定不同茶葉中草甘膦、氨甲基膦酸及草銨膦的殘留[J]. 分析化學, 2015(2): 271-276. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140708.

[4] 王海濤, 趙鈺玲, 陸地, 等. 淋洗液在線發生離子色譜法測定水中的草甘膦[J]. 食品研究與開發, 2013, 34(22): 43-45. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2013.22.013.

[5] 劉麗菁, 邱文倩, 楊艷. 免試劑離子色譜法測定飲用水中草甘膦殘留量[J]. 海峽預防醫學雜志, 2014(5): 48-50.

[6] 李小娟, 孟品佳, 王燕燕, 等. 毛細管電泳-間接紫外法測定飲用水中草甘膦、草銨膦及其代謝產物[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2015, 51(3): 307-311.

[7] 于福利, 宋正華. 流動注射化學發光技術在農藥殘留檢測中的應用[J]. 農藥, 2006(9): 584-586. DOI:10.3969/ j.issn.1006-0413.2006.09.003.

[8] CLEGG B S, STEPHENSON G R, HALL J C. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of glyphosate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(12): 5031-5037. DOI:10.1021/jf990064x.

[9] LEE H U, SHIN H Y, LEE J Y, et al. Quantitative detection of glyphosate by simultaneous analysis of UV spectroscopy and fluorescence using DNA-labeled gold nanoparticles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(23): 12096-12100. DOI:10.1021/jf102784t.

[10] GONZáLEZ-MARTíNEZ M á, BRUN E M, PUCHADES R, et al. Glyphosate immunosensor. Application for water and soil analysis[J]. Analytical Chemistry, 2005, 77(13): 4219-4227.

[11] 潘熙萍, 樓佳俊, 張高精, 等. 草甘膦殘留的酶聯免疫分析方法的建立[J]. 湖北農業科學, 2012(5): 1002-1005. DOI:10.3969/ j.issn.0439-8114.2012.05.044.

[12] 孫亞寧, 胡驍飛, 鄧瑞廣, 等. 赭曲霉毒素A人工抗原的合成與鑒定[J].食品工業科技, 2011, 32(5): 172-175.

[13] 王耀, 胡驍飛, 裴亞峰, 等. 伏馬菌素B1人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制備[J]. 核農學報, 2012(1): 113-117.

[14] 林方養, 楊耀東, 萬婕, 等. 幾種SDS-PAGE凝膠電泳染色方法的比較[J]. 安徽農業科學, 2014(8): 2295-2296. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2014.08.029.

[15] 宋娟, 王榕妹, 王悅秋, 等. 半抗原的設計、修飾及人工抗原的制備[J]. 分析化學, 2010(8): 1211-1218. DOI:10.3724/ SP.J.1096.2010.01211.

[16] 劉燕婷, 鐘青萍, 雷紅濤, 等. 基于不同載體免疫原制備河豚毒素抗體的研究[J]. 衛生研究, 2008(2): 234-236. DOI:10.3969/ j.issn.1000-8020.2008.02.031.

[17] YANG Jinyi, WANG Hong, JIANG Yueming, et al. Development of an enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA) method for carbofuran residues[J]. Molecules, 2008, 13(4): 871-881. DOI:10.3390/ molecules13040871.

[18] 雷紅濤, 龐杰, 賀麗蘋, 等. 半抗原-載體蛋白偶聯物的三種電泳鑒定方法[J]. 中國農業科學, 2010(3): 565-570. DOI:10.3864/ j.issn.0578-1752.2010.03.017.

[19] GRIFFITHS G L, CHANG C H, MCBRIDE W J, et al. Reagents and methods for PET using bispecific antibody pretargeting and68Garadiolabeled bivalent hapten-peptide-chelate conjugates[J]. Journal of Nuclear Medicine, 2004, 45(1): 30-39.

[20] TOMINAGA J, KAMIYA N, GOTO M. An enzyme-labeled protein polymer bearing pendent haptens[J]. Bioconjugate Chemistry, 2007, 18(3): 860-865. DOI:10.1021/bc060161d.

[21] ADAMCZYK M, BUKO A, CHEN Y Y, et al. Characterization of protein-hapten conjugates. 1. Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of immuno BSA-hapten conjugates and comparison with other characterization methods[J]. Bioconjugate Chemistry, 1994, 5(6): 631-635. DOI:10.1021/bc00030a019.

[22] ADAMCZYK M, GEBLER J C, MATTINGLY P G. Characterization of protein-hapten conjugates. 2. Electrospray mass spectrometry of bovine serum albumin-hapten conjugates[J]. Bioconjugate Chemistry, 1996, 7(4): 475-481. DOI:10.1021/bc960035h.

Preparation of Artif i cial Antigen and ELISA Identif i cation of Rabbit Polyclonal Antiserum for the Detection of Glyphosate

WANG Jing1,2, WANG Yao2,*, WANG Fangyu1,*, DENG Ruiguang1, HU Xiaofei1, YU Qiuying1, HAO Junfang1, XING Yunrui1,2, HOU Yuze2
(1. Henan Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Agriculture Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2. Henan Engineering Laboratory of Livestock Disease Diagnosing and Food Safety Testing, College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

To obtain polyclonal antiserum with high sensibility and specificity, artificial antigens were synthesized by coupling glyphosate (PMG) with the carrier proteins bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) separately by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and glutaraldehyde (GA) methods in this study. As a result, the immune antigen PMG-BSA and detection antigen PMG-OVA were obtained and identif i ed by UV spectroscopy and SDS-PAGE. New Zealand white rabbits were immunized with PMG-EDC-BSA and PMG-GA-BSA, respectively to obtain polyclonal antisera. The titer of the antisera was determined by indirect ELISA and their sensibility and specif i city were determined by indirect competitive ELISA. The results showed that the titer of antiserum of all three immunized rabbits was higher than 1:104. The antiserum of rabbit 2 exhibited the highest sensibility with an IC50of 30.9 μg/mL and good specif i city. The successful synthesis of artif i cial antigens and the obtainment of PMG polyclonal antiserum with high sensibility and specif i city may lay the foundation for rapid immunological detection of PMG.

glyphosate; artif i cial antigen; polyclonal antiserum; ELISA

10.7506/spkx1002-6630-201704011

S482.4

A

1002-6630（2017）04-0065-05

王晶, 王耀, 王方雨, 等. 草甘膦人工抗原的制備及兔源多抗的ELISA鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 65-69.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704011. http://www.spkx.net.cn

WANG Jing, WANG Yao, WANG Fangyu, et al. Preparation of artificial antigen and ELISA identification of rabbit polyclonal antiserum for the detection of glyphosate[J]. Food Science, 2017, 38(4): 65-69. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704011. http://www.spkx.net.cn

2016-03-28

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD13B05）；河南科技大學博士科研啟動基金項目（13480062）；河南省基礎與前沿項目（142300413222）

王晶（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：15038551637@163.com

*通信作者：王耀（1986—），男，講師，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：wangyao@haust.edu.cn

王方雨（1978—），男，副研究員，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：sprinkle.w@126.com