傳統(tǒng)霉菌發(fā)酵食品中的霉菌DNA擴(kuò)增

顧 雙，陳俊霖，王向陽(yáng)

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

傳統(tǒng)霉菌發(fā)酵食品中的霉菌DNA擴(kuò)增

顧 雙，陳俊霖，王向陽(yáng)*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

為了解市場(chǎng)上霉菌發(fā)酵食品能否擴(kuò)增霉菌DNA，除了紅曲霉外其他曲霉是否具有pksCT基因，以及加熱滅菌條件對(duì)紅曲黃酒中pksCT基因降解的影響。從市售的11 種食品中提取DNA，選用ITS基因引物和pksCT基因引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，并電泳分析。分別用麥曲、紅曲發(fā)酵黃酒，對(duì)發(fā)酵前、發(fā)酵中、滅菌后、貯藏期樣品擴(kuò)增pksCT基因并測(cè)定橘霉素質(zhì)量濃度；選擇滅菌溫度70、80、90、100 ℃，滅菌時(shí)間10、20、30 min，滅菌后樣品擴(kuò)增pksCT基因。結(jié)果表明有4 種食品能用ITS引物擴(kuò)增出條帶，但只有紅曲霉發(fā)酵的紅腐乳能擴(kuò)增出pksCT基因。紅曲黃酒在發(fā)酵中、滅菌后能夠擴(kuò)增出pksCT基因，并且在80 ℃滅菌20 min和90 ℃滅菌10 min條件下，仍然可以擴(kuò)增出pksCT基因，但90 ℃滅菌20 min或100 ℃滅菌10 min，DNA受到破壞。紅曲霉發(fā)酵食品能夠擴(kuò)增出pksCT基因，曲霉發(fā)酵的食品未能用pksCT基因引物擴(kuò)增出條帶。通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出部分霉菌發(fā)酵食品的霉菌DNA并測(cè)序，有助于了解其加工中使用的菌種，繼而為發(fā)酵加工食品的終端監(jiān)測(cè)提供一種新方法。

霉菌；發(fā)酵；pksCT基因；DNA；橘霉素

橘霉素亦稱(chēng)橘青霉素，抗菌素的一種，是真菌的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，主要由青霉、曲霉及紅曲霉等真菌產(chǎn)生[2-3]。橘霉素對(duì)人體危害極大，具有腎毒性[4]，能導(dǎo)致腫瘤，甚至誘發(fā)突變[5-6]。橘霉素廣泛存在于人們?nèi)粘Ｉ畹母黝?lèi)食品中[7-9]，如由紅曲霉、曲霉發(fā)酵而成的腐乳、醬油、黃酒類(lèi)等釀造食品中[10]，以紅曲色素為食品添加劑的肉制品、魚(yú)制品、蔬菜腌制品中及各類(lèi)生鮮水果蔬菜中[11]。而多數(shù)霉菌發(fā)酵的食品在加工后仍含有較高含量的橘霉素，且降解效果并不是十分理想，有研究表明橘霉素的某些降解產(chǎn)物也帶有相當(dāng)?shù)亩拘裕玳倜顾豀、。

1

研究者多從分子水平上著手，選育不產(chǎn)橘霉素的紅曲霉菌種[13-14]。Shimizu等[15]于2005年從紫色紅曲菌中首次克隆得到了一個(gè)與生物合成橘霉素相關(guān)的基因—pksCT基因。2008年付桂明等[16]選取7 種共14 株產(chǎn)橘霉素的紅曲菌，運(yùn)用基因組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分析方法，對(duì)pksCT基因進(jìn)行保守性分析，認(rèn)為其具有高度同源性，普遍存在于產(chǎn)橘霉素的紅曲菌中。自從pksCT基因被報(bào)道以后，學(xué)者開(kāi)始應(yīng)用生物技術(shù)來(lái)篩選菌種，通過(guò)基因和代謝調(diào)控橘霉素的產(chǎn)生。丁月娣[17]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紅色紅曲霉，并對(duì)T-DNA進(jìn)行擴(kuò)增分析，研究產(chǎn)橘霉素的相關(guān)基因。Hajjan等[18]認(rèn)為橘霉素與紅曲色素開(kāi)始于同一個(gè)生物合成途徑。目前對(duì)pksCT基因的報(bào)道僅限于紅曲霉屬霉菌，其他曲霉是否也有pksCT基因并不清楚。本研究利用霉菌的ITS序列擴(kuò)增霉菌發(fā)酵食品的DNA，并用pksCT基因引物對(duì)曲霉發(fā)酵食品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期了解除了紅曲霉外，其他曲霉是否有pksCT基因，發(fā)酵加工食品中能否擴(kuò)增出霉菌DNA。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11 個(gè)不同品牌或同品牌不同類(lèi)型發(fā)酵食品（醬油1、醬油2、黃酒1、黃酒2、黃酒3、米醋1、米醋2、米醋3、腐乳1、腐乳2、腐乳3）購(gòu)自浙江杭州聯(lián)華超市；黃酒曲1、黃酒曲2為網(wǎng)上購(gòu)買(mǎi)。

Taq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTPs Takara寶生物技術(shù)有限公司；緩沖液50×TAE、6×loading buffer杭州昊天生物技術(shù)有限公司；核酸染料 上海賽北盛生物技術(shù)有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-XP-G PCR擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-2C電泳儀 北京市六一儀器廠；蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；SHZ-82恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 市售霉菌發(fā)酵食品樣品處理

分別取30 mL黃酒、醬油、米醋以及30 g腐乳在45 ℃條件下旋蒸濃縮后，提取DNA，選用ITS和pksCT基因引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳并凝膠成像分析。

1.3.2 黃酒加工各時(shí)期pksCT基因擴(kuò)增處理

黃酒發(fā)酵分別使用黃酒曲1（含有熟麥曲、酵母、淀粉酶等，黃綠色）和黃酒曲2（含有紅曲霉等，棕紅色），曲-米質(zhì)量比1∶20，發(fā)酵20 d。使用黃酒曲1的發(fā)酵酒為黃色，使用黃酒曲2的發(fā)酵酒為紅色。分別取黃酒發(fā)酵前（未添加酒曲）、發(fā)酵中（發(fā)酵10 d的料液）、發(fā)酵結(jié)束（80 ℃條件下滅菌10 min）和貯藏期（滅菌后7 d）4 個(gè)階段的黃酒10 mL，無(wú)菌水稀釋至30 mL，4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集沉淀，冰浴條件下研磨，樣品提取DNA，選用pksCT基因引物，PCR擴(kuò)增后電泳凝膠成像，并測(cè)定各階段對(duì)應(yīng)的橘霉素質(zhì)量濃度。

1.3.3 紅曲黃酒滅菌溫度和時(shí)間對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

由于黃酒曲1發(fā)酵的黃酒，未能得到清晰的pksCT基因條帶，此處樣品選擇黃酒曲2發(fā)酵的黃酒。分別選用70、80、90、100 ℃滅菌10、20、30 min的黃酒樣品，提取DNA，用pksCT基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后電泳凝膠成像。

1.3.4 DNA的提取

采用真菌提取DNA試劑盒提取。

1.3.5 ITS基因引物的PCR擴(kuò)增

[19]，分別以黃酒、米醋、腐乳及醬油中提取的DNA為模板，以18S rRNA為靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其引物序列為pITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和pITS4：5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，31 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系（50 μL）為：5 μL 10×PCR buffer、5 μL dNTPs （2.0 mmol/L）、4 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.0 μL引物（10 μmol/L）、5 μL模板基因組DNA（50 ng/μL）、0.5 μL Taq酶（5.0 U/ μL）、28.5 μL無(wú)菌水。

1.3.6 pksCT基因引物的PCR擴(kuò)增

參照GenBank中公布的紫色紅曲菌中pksCT基因序列（No. AB167465）設(shè)計(jì)引物[14]，引物序列為K（5’-GGGGATCCCCGAAGGAGATAAACAGTGAG AG-3’）和L（5’-GCTCATGAAGGCGTTGATGAGATG TAG-3’）。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min、56 ℃梯度溫度退火1 min、72 ℃延伸1 min、30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系（20 μL）為：2 μL 10×PCR buffer、2 μL dNTPs（2.0 mmol/L）、1.6 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.0 μL引物（10 μmol/L）、2 μL模板基因組DNA（50 ng/μL）、Taq酶（5.0 U/μL）0.2 μL、無(wú)菌水10.2 μL。

1.3.7 PCR擴(kuò)增片段電泳分析

PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳電壓為100 mV，時(shí)間30 min，電泳結(jié)束后，用Quanity One分析軟件對(duì)上述電泳完成的瓊脂糖凝膠進(jìn)行成像處理。

1.3.8 黃酒釀制各階段的橘霉素質(zhì)量濃度測(cè)定

橘霉素檢測(cè)參照Franco等[20]的高效液相色譜法。色譜條件為：色譜柱Hypersil ODS 2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（色譜純）及體積分?jǐn)?shù)60%三氟乙酸；RF-20A熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)331 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Microsoft Off i ce 2007 Excel軟件進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算，結(jié)果表示為±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌發(fā)酵食品中ITS基因引物擴(kuò)增結(jié)果

圖1 醬油、米醋、腐乳及黃酒ITS 基因引物的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplif i ed products with ITS gene primer of DNA extracts from soy sauce, rice vinegar, fermented bean curd and yellow rice wine

如果ITS基因引物能擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明存在真菌的DNA，并且該基因的DNA序列還是完好的。ITS序列可用于對(duì)真菌的不同生物型、菌株、種、屬進(jìn)行分類(lèi)鑒定，其序列長(zhǎng)度600～800 bp[21-22]。泳道1、5、8、11在750～1 000 bp之間相同位置都出現(xiàn)很亮的條帶。醬油1、米醋3、腐乳3、黃酒3這4 個(gè)產(chǎn)品PCR擴(kuò)增效果好，說(shuō)明這些加工產(chǎn)品中霉菌的DNA還沒(méi)有分解。未來(lái)可以利用PCR技術(shù)，進(jìn)一步基因測(cè)序?qū)庸ぶ兴玫拿咕M(jìn)行鑒定（圖1）。

2.2 pksCT基因引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)ITS能夠擴(kuò)增的米醋、腐乳、醬油、黃酒這4 種產(chǎn)品經(jīng)pksCT基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，發(fā)現(xiàn)只有泳道2在700 bp左右處出現(xiàn)了很亮的條帶。這與資料中顯示pksCT基因長(zhǎng)度為684 bp相吻合[14]。紅色腐乳有紅曲霉，能擴(kuò)增出pksCT基因[23-24]。而米醋、醬油、黃酒都沒(méi)有紅曲霉，只有曲霉等，曲霉合成橘霉素的基因也許與紅曲的pksCT基因有差異，因此難以用該引物擴(kuò)增出條帶；也可能因?yàn)榧訜釡缇忍幚碇率笵NA降解，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。

圖2 醬油、米醋、腐乳及黃酒的pksCT 基因引物的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplif i ed products with pksCT gene primer of DNA extracts from soy sauce, rice vinegar, fermented bean curd and yellow rice wine

2.3 紅曲黃酒釀制過(guò)程中的pksCT基因擴(kuò)增和橘霉素質(zhì)量濃度結(jié)果

圖3 不同加工時(shí)期黃酒pksCT 基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Agarose gel electropheresis of PCR amplif i ed products with pksCT gene primer of DNA extracts from yellow rice wine at different processing stages

表1 不同黃酒加工時(shí)期的橘霉素質(zhì)量濃度Table1 Citrinin contents of yellow rice wine at different processing stages

使用黃酒曲1（曲霉）發(fā)酵的麥曲黃酒沒(méi)有擴(kuò)增出清晰的pksCT基因，而使用黃酒曲2（紅曲霉）發(fā)酵的紅曲黃酒能夠擴(kuò)增出pksCT基因條帶。由圖3、表1可知，紅曲黃酒在發(fā)酵前沒(méi)有擴(kuò)增出pksCT基因片段，而發(fā)酵過(guò)程中及滅菌后都出現(xiàn)了該片段。相應(yīng)的發(fā)酵前橘霉素質(zhì)量濃度極低，發(fā)酵過(guò)程及滅菌后橘霉素質(zhì)量濃度大幅度上升。pksCT基因經(jīng)過(guò)80 ℃滅菌后，還是能夠保持穩(wěn)定，橘霉素同樣繼續(xù)存在。在黃酒滅菌后第7天，未能擴(kuò)增出pksCT基因，說(shuō)明其已被降解，此時(shí)橘霉素質(zhì)量濃度稍高于滅菌后，說(shuō)明橘霉素比較穩(wěn)定[25]。

2.4 紅曲黃酒滅菌溫度和時(shí)間對(duì)pksCT基因的影響

圖4 不同加熱滅菌條件后黃酒pksCT基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electropheresis of PCR amplif i ed products with pksCT gene primer of DNA extracts from yellow rice wine under different thermal sterilization conditions

由圖4可知，發(fā)酵后的紅曲黃酒在70、80 ℃條件下處理10、20 min，90 ℃條件下處理10 min，能夠擴(kuò)增出pksCT基因；但90 ℃條件下處理20 min及100 ℃條件下處理10 min，均未能擴(kuò)增出pksCT基因，說(shuō)明強(qiáng)度較低的熱殺菌可以保留霉菌DNA模板基因組。市售的一些產(chǎn)品能夠保留霉菌DNA序列，而本實(shí)驗(yàn)室制備的紅曲黃酒貯藏7 d后，霉菌DNA序列已經(jīng)分解，可能與制備完成后沒(méi)有嚴(yán)格密封有關(guān)。

3 結(jié) 論

市場(chǎng)上部分黃酒、米醋、腐乳、醬油樣品能擴(kuò)增出真菌ITS特征基因，但只有紅腐乳擴(kuò)增出pksCT基因序列。這與紅腐乳使用紅曲霉發(fā)酵，而黃酒、米醋、醬油使用曲霉發(fā)酵有關(guān)。用pksCT基因序列引物不能擴(kuò)增出非紅曲霉發(fā)酵食品的pksCT基因，說(shuō)明曲霉沒(méi)有pksCT基因，或者其核酸序列不同于紅曲霉pksCT的核酸序列，導(dǎo)致無(wú)法擴(kuò)增出pksCT基因。兩種黃酒發(fā)酵的霉菌酒藥，添加紅曲米酒藥的黃酒能夠擴(kuò)增出pksCT基因，而添加麥曲酒藥的黃酒未能擴(kuò)增出pksCT基因。紅曲黃酒在發(fā)酵過(guò)程及80 ℃滅菌20 min或90 ℃滅菌10 min滅完菌后的樣品中可以擴(kuò)增出pksCT基因，但是更強(qiáng)的滅菌條件，90 ℃滅菌20 min，將破壞pksCT基因。橘霉素主要在發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生，低強(qiáng)度滅菌橘霉素未能降解，紅曲黃酒經(jīng)過(guò)7 d常溫貯藏，紅曲霉的pksCT基因降解，而橘霉素未能降解。

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Mold DNA Amplif i cation from Traditional Mold Fermented Foods

GU Shuang, CHEN Junlin, WANG Xiangyang*
(School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)

This study aimed to fi nd out whether mold DNA can be amplif i ed from traditional mold fermented foods and whether Aspergillus besides Monascus carries pksCT gene. The effect of thermal sterilization conditions on the degradation of the pksCT gene in red kojic rice wine was examined as well. Eleven samples of soy sauce, rice vinegar, fermented bean curd and yellow rice wine collected from local market were used for DNA extraction. Polymerase chain reaction (PCR) amplif i cation was carried out with internal transcribed spacer (ITS) and pksCT gene primers. Rice wine was fermented by wheat koji and red koji, respectively, and then the pksCT gene was amplif i ed and citrinin contents were measured before and during fermentation, after sterilization, and during storage. Samples were sterilized at 70, 80, 90, 100 ℃ for 10, 20, and 30 min, respectively, and then were subjected to PCR amplification. The results showed that DNA fragments were successfully amplified with the ITS primer from 4 samples, including soy sauce, rice vinegar, fermented bean curd and yellow rice wine. However, the pksCT gene was successfully amplif i ed only from red bean curd fermented by Monascus. We failed to amplify the pksCT gene from yellow rice wine fermented by wheat koji. The pksCT gene was successfully amplif i ed from red kojic rice wine during fermentation and after sterilization. Meanwhile, citrinin content increased rapidly at these sampling points. When red kojic rice wine was sterilized at 80 ℃ for 20 min or 90 ℃ for 10 min, the pksCT gene remained amplif i able, while after sterilization at 90 ℃ for 20 min or 100 ℃ for 10 min, DNA structure was damaged. The pksCT gene was amplif i able in Monascus fermented foods, but not in Aspergillus fermented foods. It is implied that mold DNA in fermented foods can be amplif i ed by PCR and sequenced, which may be helpful for inspectors to fi nd out what kinds of strains are contained in mold fermented foods, and provides a new terminal monitoring method for mold fermented foods.

mold; fermentation; pksCT gene; DNA; citrinin

10.7506/spkx1002-6630-201704014

TS201.3

A

1002-6630（2017）04-0083-04

顧雙, 陳俊霖, 王向陽(yáng). 傳統(tǒng)霉菌發(fā)酵食品中的霉菌DNA擴(kuò)增[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 83-86. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704014. http://www.spkx.net.cn

GU Shuang, CHEN Junlin, WANG Xiangyang. Mold DNA amplif i cation from traditional mold fermented foods[J]. Food Science, 2017, 38(4): 83-86. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704014. http://www.spkx.net.cn

2016-05-03

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY15C200005）

顧雙（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：gushuang025@163.com

*通信作者：王向陽(yáng)（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣哔A藏保鮮與保健食品。E-mail：wxy200228@sina.com