仙人掌果酒發酵動力學及其抗氧化性

李 雪，白新鵬，曹 君，趙 曄，武林賀，張宇翔，馬若影

（海南大學食品學院，生物活性物質與功能食品開發重點實驗室，海南 海口 570228）

仙人掌果酒發酵動力學及其抗氧化性

李 雪，白新鵬*，曹 君*，趙 曄，武林賀，張宇翔，馬若影

（海南大學食品學院，生物活性物質與功能食品開發重點實驗室，海南 海口 570228）

以仙人掌果汁為原料，添加SY型安琪酵母進行恒溫發酵并對其發酵動力學和抗氧化性進行研究。每隔12 h測定仙人掌果酒的酵母菌數、酒精度、還原糖量，針對實驗數據，應用Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型對其進行非線性擬合。同時在果酒發酵的各個階段測定了總酚和黃酮的含量及其抗氧化性，了解其變化規律。實驗結果顯示：3 種模型的模擬預測值和實測值的擬合度均大于0.99，模擬擬合度較好，綜合反映了仙人掌果酒發酵過程的動力學特征。總酚和黃酮含量相對較高，清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基效果顯著，Fe3+還原能力良好。

仙人掌果；發酵動力學；抗氧化性

仙人掌果為熱帶植物仙人掌的果實，表皮為紫色、青綠色或者金黃色，果肉為紫色或紅色，可以食用，口感微酸甜。仙人掌在我國海南、云南、廣西等地均有分布，是一種資源豐富的野生植物。仙人掌果實富含糖、氨基酸、有機酸、礦物質、維生素等營養物質，還含有大量的黃酮類物質，另外它還含有果膠、色素和三萜化合物，以及珍貴的玉芙蓉、抱壁蓮和角蒂仙等[1]。經研究，仙人掌果有行氣活血、祛濕退熱、清熱解毒、提高免疫力、抗腫瘤抗癌，降低血糖血脂血壓、清除自由基等作用[2]。馬丹雅等[3]用乙醇提取仙人掌果肉紅色素，發現仙人掌果紅色素色澤艷麗、穩定性強。Reddy等[4]通過高效液相色譜法分析果酒中所含活性成分，發現果酒中活性成分明顯高出水果。

發酵動力學可對實驗過程進行定量分析，對實驗指標進行較為準確的預測，對發酵過程放大及從分批發酵過渡到連續發酵有著重要指導作用[5]。通過對仙人掌果酒進行發酵動力學分析，可以為日后工業標準化生產提供依據。仙人掌果酒發酵過程中，產物酒精的生成與基質糖的消耗及菌體的生長都有著直接的關系。本實驗采用經驗模型中的Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型對實驗數據進行非線性擬合，建立發酵動力學模型，為仙人掌果酒的發酵生產控制提供了理論支持。

自由基是機體氧化反應中產生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起機體慢性疾病及衰老效應[6]。雖然測定物質抗氧化性的方法很多，但還沒有一種方法可以綜合地評價物質的抗氧化能力，應選取多個體系綜合考察物質的抗氧化性。本實驗采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）法測定物質抗氧化能力，普魯士藍法測定還原能力，通過比較仙人掌果原汁及果酒不同發酵階段的抗氧化性，了解其變化規律。

目前市面上有仙人掌的加工利用，但是仙人掌果的加工鮮有報道。由于仙人掌果實的表皮覆蓋著倒鉤狀刺，內部還有八角刺，果肉多籽，不利于經常食用。通過把仙人掌果釀成果酒，不僅能保持其保健價值，同時還可以豐富人們的日常飲食，具有經濟價值[4]。仙人掌果發酵成果酒，酒性溫和，色澤艷麗，風味獨特，具有清熱解毒、美容養顏及抗氧化等功效。通過發酵動力學及抗氧化性研究，可以為日后更好地開發仙人掌果提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙人掌果為海南三亞市售。

釀酒酵母采用SY型葡萄酒、果酒專用酵母，購于安琪酵母股份有限公司。

果膠酶 法國萊蒙特集團；白砂糖 香港藝龍源食品有限公司；酒石酸鉀鈉、NaOH（均為分析純）廣州化學試劑廠；DPPH 西亞試劑；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇凈安泰空氣技術有限公司；MLR-351恒溫培養箱 日本三洋電機貿易株式會社（北京）；DA-130N酒精計 日本京都電子工業株式會社；G154DW壓力蒸汽滅菌鍋 美國致微（廈門）儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠；HB43-S快速水分測定儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；723 PC可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 仙人掌果酒發酵工藝流程

仙人掌果→清洗→去皮去刺、取果肉→打漿→過濾去籽→酶解→調整糖度與pH值→接種發酵→恒溫發酵培養→分析測定。

加白砂糖調整糖度至21 °Brix，加檸檬酸調整pH值至4.0，65 ℃條件下巴氏殺菌10 min，室溫冷卻至常溫，接入質量分數10%的酵母，23 ℃條件下恒溫發酵。

1.3.2 仙人掌果基本成分分析

采用索氏抽提法測定仙人掌果肉粗脂肪含量[7]；利用HB43-S快速水分測定儀測定仙人掌果肉水分；根據GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》測定仙人掌果肉的灰分含量[8]；根據GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》，采用凱氏定氮法測定仙人掌果肉的蛋白質含量[9]；根據GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》測定仙人掌果肉的總酸含量[10]；根據3,5-二硝基水楊酸比色法測定仙人掌果肉的可溶性糖含量。

1.3.3 發酵動力學模型的建立

采用血球計數板計算酵母菌濃度。還原糖質量濃度根據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，采用斐林試劑滴定法測定[11]；酒精度根據GB/T 15038—2006，采用酒精計法測定[11]。

1.3.4 樣液的制備

[12]，準確稱取5.00 g樣品于100 mL三角瓶中，加入25 mL 70%的乙醇溶液，超聲水浴浸提30 min，提取液6 000 r/min離心10 min。濾液倒入100 mL容量瓶中。濾渣用20 mL 70%乙醇溶液洗進原三角瓶中，搖勻，超聲水浴30 min，提取液6 000 r/min離心10 min，倒入上述100 mL容量瓶中。2 次離心液用70%乙醇溶液定容至100 mL即為樣液。

1.3.5 總酚、黃酮的制備與測定

1.3.5.1 總酚的制備與測定

采用Folin-Ciocalteu法測定酚類物質含量[13]。準確稱取沒食子酸0.01 g至100 mL容量瓶，純水定容至刻度。分別移取0、1、2、3、4、5、6 mL標準溶液于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度即為待測液。取0.5 mL樣液于試管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L福林酚試劑，搖勻后避光反應5 min，再加入7.5 g/100 mL的Na2CO3溶液2 mL搖勻避光反應90 min，于760 nm波長處測定吸光度，蒸餾水調零。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線。

分別取仙人掌果肉原汁及不同發酵階段的果酒按照1.3.4節的方法制備樣液。吸取樣液1.25 mL，蒸餾水定容至25 mL，再取0.5 mL稀釋后的樣液于試管中，按照上述沒食子酸測定方法測定吸光度。總酚含量按公式（1）計算。

式中：x為根據標準曲線計算得出的沒食子酸質量濃度/（mg/mL）；25為稀釋倍數；m為樣品質量/g。

1.3.5.2 黃酮的制備與測定

采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法測定黃酮含量[14]。準確稱取0.02 g蘆丁用95%乙醇溶液定容至100 mL容量瓶即為蘆丁標準液。分別移取0、1、2、3、4、5、6 mL置于25 mL容量瓶中，加入4 g/100 mL的NaNO2溶液 1 mL，搖勻后避光反應6 min。再加入8 g/100 mL的Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻后避光反應6 min。再加入12 g/100 mL的NaOH溶液10 mL，純水定容至25 mL。避光靜置15 min，于510 nm波長處測吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。

分別取仙人掌果肉原汁及不同發酵階段的果酒按照1.3.4節的方法制備樣液。吸取樣液1 mL，按照上述方法測定吸光度。黃酮含量按公式（2）計算。

式中：x為根據標準曲線計算得出的沒食子酸質量濃度/（μg/mL）；m為樣品質量/g；0.5為稀釋倍數。

1.3.6 抗氧化性測定

1.3.6.1 清除DPPH自由基能力測定

分別取仙人掌果肉原汁及不同發酵階段的果酒按照1.3.4節的方法制備樣液。取1 mL樣液，用70%乙醇溶液定容至10 mL即為待測液。取100 μL待測液，加入4.9 mL 6.5×10-5mol/L DPPH無水乙醇溶液，搖勻后避光反應40 min，于510 nm波長處測吸光度，無水乙醇調零。DPPH自由基清除率按公式（3）計算。

式中：A0為未加樣品的DPPH無水乙醇溶液吸光度；AS為樣品與DPPH無水乙醇溶液反應后的吸光度。

1.3.6.2 清除ABTS+·能力測定

參考文獻[15]，按照1.3.4節方法制備樣液，取1 mL樣液，用70%乙醇溶液定容至10 mL即為待測液。移取1 mL 10 mmol/L H2O2-ABTS-醋酸鹽緩沖液，蒸餾水稀釋至30 mL，再移取6 mL稀釋后的ABTS反應液，加入40 μL待測液，迅速振蕩，于734 nm波長處測吸光度，以30 mmol/L醋酸鈉溶液調零。ABTS+·清除率按公式（4）計算。

式中：A0為未加樣品的ABTS溶液吸光度；At為樣品與ABTS溶液反應后的吸光度。

1.3.6.3 Fe3+還原能力測定

參考文獻[16]測定，配制質量濃度為0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 mg/mL的VC溶液，測其吸光度，繪制VC標準曲線。

按照1.3.4節方法制備樣液。取1 mL樣液，用70%乙醇溶液定容至10 mL。取1 mL待測液，加入1 mL PBS（pH 6.6），再加入1 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液，搖勻，50 ℃條件下反應20 min，取出冷卻至室溫。加入1 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸溶液，再加入0.2 mL 0.1 g/100 mL的三氯化鐵溶液，搖勻，避光靜置10 min，于700 nm波長處測其吸光度，蒸餾水調零。結果以每克樣品中含有相當VC的量表示，單位為g VC/g。

1.4 數據分析與處理

實驗設3 組平行，結果取平均值。應用Origin 9.0軟件對菌體生長、基質消耗、產物生成情況建立動力學模型[17-18]。

根據實驗數據分析，酵母的生長呈“S”型曲線，結合經驗模型，選取典型的“S”曲線模型：Logistic模型、SGompertz模型、Botlezman模型進行非線性擬合，比較三者的擬合度，R2越大，擬合度越高，故選取擬合相關系數最大的模型對其進行描述。酒精的生成與酵母的生長有直接關系，因此屬于生長“偶聯”型，選用上述3 種經典模型對其進行非線性擬合，選取擬合相關系數最大的模型對其進行描述[19]。果酒發酵過程中主要利用可還原糖合成酒精[18]，因此選用經典模型中的DoseResp模型、Logistic模型與Botlzman模型進行非線性擬合，選取擬合相關系數最大的模型對其進行描述。

應用Origin 9.0軟件對仙人掌果原汁及果酒不同發酵階段的總酚、黃酮含量和抗氧化性進行分析比較。

2 結果與分析

2.1 仙人掌果的基本成分

經測定，仙人掌果中水分含量為86.3 g/100 g，灰分含量為0.33 g/100 g，粗蛋白含量為4.02 g/100 g，粗脂肪含量為0.039 g/100 g，可溶性糖含量為4.8 g/100 g，總酸含量為0.22 g/100 g，結果表明仙人掌果含有豐富的蛋白質。

2.2 仙人掌果酒發酵過程中酵母菌濃度、酒精度、還原糖質量濃度的變化規律

圖1 仙人掌果酒發酵過程中酵母菌濃度、酒精度、還原糖質量濃度的變化規律Fig.1 Evolution of yeast number, alcohol content, and reducing sugar concentration during the fermentation of cactus wine

由圖1可知，釀酒酵母的生長規律比較典型，各個階段比較分明。24 h后逐步進入對數生長期，96 h后趨于達到穩定期，菌體生物量最高值為1×108CFU/mL。還原糖在132 h前消耗比較快，之后糖消耗量緩慢降低。酒精度在12 h后增長較快，在132 h后趨于平緩，最大值為14.8%。

2.3 仙人掌果酒的發酵動力學模型

2.3.1 酵母菌數生長動力學模型

由表1可知，對比Logistic模型、SGompertz模型及Boltzmann模型的擬合相關系數，SGompertz模型擬合效果最好，相關系數R2為0.997 28。故選用SGompertz模型對仙人掌果酒酵母菌數的生長情況進行擬合，此結論與李俠等[19]關于紅棗酒酵母菌數擬合模型一致，擬合曲線如圖2。

表1 酵母菌數的擬合方程及其相關系數Table1 Fitting equations with correlation coeff i cients for yeast count

由圖2可知，酵母菌在仙人掌果酒發酵24 h后生長速率開始提高，24～96 h呈對數生長，在96 h后，菌體幾乎不再生長，趨于平緩，進入穩定期。

圖2 SGompertz模型下酵母菌生長擬合曲線Fig.2 SGompertz model describing yeast growth

2.3.2 產物生成動力學模型

表2 產物生成擬合方程及其相關系數Table2 Fitting equations with correlation coeff i cients for alcohol content

圖3 Logistic模型下產物生成擬合曲線Fig.3 Logistic model describing alcohol content

由表2可知，對比Logistic模型、SGompertz模型及Boltzmann模型的擬合相關系數，Logistic模型擬合效果最好，相關系數R2為0.998 03，故選用Logistic模型擬合產物生成曲線，結論與張勇等[20]關于蜂蜜酒產物擬合方程所選一致，曲線如圖3。

由圖3可知，酒精度在12 h后開始增加，在132 h后趨于平緩，最大值為14.8%。仙人掌果較一般水果易于發酵，且容易發酵成高度數果酒。普通水果正常發酵酒精度一般在8%～12%[21]，但是仙人掌果酒酒精度相對來說較高，可能因為仙人掌果自帶原始菌群利于仙人掌果發酵。

2.3.3 基質消耗動力學模型

由表3可知，對比DoseResp模型、Logistic模型與Boltzmann模型3 種模型的擬合相關系數，DoseResp模型擬合效果最好，相關系數R2為0.998 10。故選用DoseResp模型擬合基質消耗過程[19]。

表3 基質消耗擬合方程及其相關系數Table3 Fitting equations with correlation coeff i cients for substrate consumption

圖4 DoseResp模型下基質消耗擬合曲線Fig.4 DoseResp model describing substrate consumption

由圖4可知，還原糖在132 h前消耗比較快，之后糖消耗量緩慢降低，與酒精度值幾乎同步進行。果酒發酵過程中，糖被還原產生能量供酵母新陳代謝所需，生成酒精[19]。

2.4 總酚、黃酮含量及其抗氧化性變化

2.4.1 仙人掌果發酵過程中總酚含量變化

圖5 總酚含量變化Fig.5 Change in total phenol content with fermentation time

沒食子酸標準曲線方程為y＝11.928 75x+0.039 29（R2＝0.999 01）。根據上述方程及實驗所測吸光度，換算為總酚含量。

由圖5可知，仙人掌果總酚含量在發酵過程中呈現先上升后下降的趨勢。主要上升階段集中在發酵開始后24～96 h內，因為此階段為仙人掌果酒主要發酵階段，出汁量較多，使得果酒的總酚含量增加。在發酵后期，總酚含量開始降低，132 h后緩慢減少。隨著酵母菌和仙人掌果原始菌群的生長繁殖，代謝過程中產生的酶，分解了多酚等大分子物質，使得酚含量降低。發酵結束后，果酒的總酚含量相對原汁有所增加，此結論與于立梅等[22]關于山竹酒發酵過程中總酚變化趨勢的結論一致。

2.4.2 仙人掌果發酵過程中黃酮含量變化

蘆丁標準曲線方程為：y＝0.016 15x+0.020 12（R2＝0.995 19）。由方程及實驗所測數據，計算仙人掌果原汁及其發酵各個階段黃酮含量。

圖6 黃酮含量變化Fig.6 Change in total fl avonoids content with fermentation time

由圖6可知，仙人掌果原汁所含黃酮相對較少，發酵過程中，黃酮含量呈現先上升后下降的趨勢。開始發酵后，黃酮含量迅速增加，96 h后發酵趨近平緩，黃酮含量開始迅速下降。132 h后下降速率趨于平緩，但發酵后果酒總黃酮含量相對原汁高出很多。發酵前中期，由于仙人掌果大量出汁，酒精含量不斷增加，黃酮的溶解量不斷增加[23]。發酵后期，由于發酵菌株對黃酮的分解及黃酮的不穩定性，使得黃酮含量下降。發酵趨于結束時，黃酮幾乎全部溶于發酵液，含量基本不變。

2.5 果酒抗氧化性變化

2.5.1 發酵過程中DPPH自由基清除率變化

圖7 仙人掌果原汁及發酵過程中DPPH自由基清除率變化Fig.7 Change in DPPH radical scavenging capacity during the fermentation of cactus juice

由圖7可知，DPPH自由基清除率總體呈現先微弱上升后微弱下降的趨勢，與發酵過程中總酚和黃酮的含量變化趨勢較符合，總體變化不明顯。發酵前中期，DPPH自由基清除率緩慢上升，因為在此階段，仙人掌果發酵速率較快，大量出汁，抗氧化性物質含量增加。發酵后期，DPPH自由基清除率緩慢下降，幾乎與原汁DPPH自由基清除率持平，可能因為黃酮的不穩定性及發酵過程中產生的酶分解了酚類等大分子物質，導致抗氧化性降低[24]。

2.5.2 發酵過程中ABTS+·清除率變化

圖8 仙人掌果原汁及發酵過程中ABTS＋·清除率變化Fig.8 Change in ABTS radical scavenging capacity during the fermentation of cactus juice

由圖8可知，ABTS+·清除率與DPPH自由基清除率趨勢變化幾近相同。總體呈現先上升后下降的趨勢，發酵中酚類物質可形成解離和聚合的復雜反應，且這些反應與溫度、時間、浸漬效果等多種因素有關，仙人掌果酒中總酚、黃酮含量與ABTS+·清除率呈正相關，此結論與焦揚等[25]的研究結果一致。

2.5.3 發酵過程中Fe3+還原能力變化

圖9 仙人掌果原汁及發酵過程中Fe3＋還原能力變化Fig.9 Changes in Fe3+reducing power during the fermentation of cactus juice

由圖9可知，發酵過程中Fe3+還原能力為先下降后上升。發酵中期還原能力最弱。發酵結束后，雖然還原能力有所增強，但是總體還原能力弱于仙人掌果原汁，可能是因為發酵過程中，仙人掌果大量出汁，生成了某些物質，使Fe3+轉換Fe2+，削弱了Fe3+還原能力[25]。

3 結 論

通過采用Origin 9.0軟件對試驗數據進行分析，并采用經典模型Logistic、DoseResp、SGompertz對其進行非線性擬合，得到相關擬合方程，相關系數均大于0.99，說明所選的方程能夠很好地模擬仙人掌果酒發酵過程。本研究主要考察仙人掌果酒發酵過程中的酵母菌生長情況及特征物質的變化規律。結果表明，仙人掌果酒主要發酵階段集中在24～96 h。

仙人掌果酒發酵前中期，酵母菌大量生長繁殖，酒精度迅速增大，總酚和黃酮含量也開始增加，抗氧化能力緩慢上升。96 h后由于酶等大分子物質的產生、發酵菌株的分解作用及和黃酮自身的不穩定性等因素，總酚和黃酮含量均相對降低。

仙人掌果及其發酵果酒的抗氧化能力都比較高，其DPPH自由基和ABTS+·清除率均大于60%。仙人掌果發酵果酒的抗氧化能力與原果沒有顯著差異，表明將仙人掌果發酵釀酒后仍較好地保留了其原有的抗氧化性能。

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Fermentation Kinetics and Antioxidant Activity of Cactus Wine

LI Xue, BAI Xinpeng*, CAO Jun*, ZHAO Ye, WU Linhe, ZHANG Yuxiang, MA Ruoying
(Key Laboratory of Biological Active Substances and Functional Food Development, College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

The fermentation kinetics at a constant temperature and antioxidant activity of cactus wine produced from cactus juice using SY-type Angel-branded yeast were studied. Yeast count, alcohol content, and reducing sugar in cactus wine were determined after every 12 h, and the experimental data were nonlinearly fi tted to the Logistic, SGompertz and DoseResp models. Meanwhile, changes in the contents of total phenol and flavonoids and antioxidant activity of the wine were investigated as a function of fermentation time. The experimental results showed that the fi tness of all the three models was conf i rmed by a satisfactory value of determination coeff i cient, which was calculated to be greater than 0.99. In addition, it was also shown that the contents of total phenol and fl avonoids were relatively high in cactus wine. Cactus wine exhibited remarkable free radical scavenging activities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate and potent Fe3+reduction power.

cactus wine; fermentation kinetics; antioxidant activities

10.7506/spkx1002-6630-201704015

TS209

A

1002-6630（2017）04-0087-06

李雪, 白新鵬, 曹君, 等. 仙人掌果酒發酵動力學及其抗氧化性[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 87-92. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704015. http://www.spkx.net.cn

LI Xue, BAI Xinpeng, CAO Jun, et al. Fermentation kinetics and antioxidant activity of cactus wine[J]. Food Science, 2017, 38(4): 87-92. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704015. http://www.spkx.net.cn

2016-05-16

海南省自然科學基金項目（20153159）；海南省高等學校科研項目（Hnky2016ZD-1）；海南大學科研啟動基金項目（kyqd1608）

李雪（1991—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏工程。E-mail：lixuelala@163.com

*通信作者：白新鵬（1963—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂和植物蛋白質工程。E-mail：xinpeng2001@126.com

曹君（1986—），女，講師，博士，研究方向為營養、保健與功能食品。E-mail：juncaoyd2007@126.com