全自動(dòng)氨基酸分析儀法測(cè)定4 種貝類(lèi)肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量

張?zhí)K平，邱偉強(qiáng)，盧 祺，陳舜勝

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

全自動(dòng)氨基酸分析儀法測(cè)定4 種貝類(lèi)肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量

張?zhí)K平，邱偉強(qiáng)，盧 祺，陳舜勝*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

建立一種測(cè)定貝類(lèi)肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸的全自動(dòng)氨基酸分析儀法，以4 種常見(jiàn)貝類(lèi)為研究對(duì)象，采用0.02 mol/L鹽酸溶液作為提取劑，體積分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸溶液為蛋白沉淀劑，同時(shí)優(yōu)化了緩沖溶液的組成及洗脫程序，并對(duì)該方法的線性范圍、檢出限、精密度以及回收率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：貝類(lèi)肌肉中的谷胱甘肽和游離氨基酸有著較好的分離效果，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 9，檢出限（RSN=3）為0.07～0.27 μmol/L，加標(biāo)平均回收率為86.40%～102.42%，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.31%～0.73%和1.14%～2.60%。4 種貝類(lèi)肌肉組織中的游離氨基酸含量比較豐富，總游離氨基酸含量分別為1 396.39、1 016.04、911.15、287.01 mg/100 g，文蛤＞青蛤＞縊蟶＞牡蠣，主要的游離氨基酸為牛磺酸（Tau）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）；谷胱甘肽含量分別為103.20、82.53、61.77、33.37 mg/100 g，青蛤＞文蛤＞縊蟶＞牡蠣。該方法適用于貝類(lèi)肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量的測(cè)定與分析。

貝類(lèi)肌肉；谷胱甘肽；游離氨基酸；全自動(dòng)氨基酸分析儀法

貝類(lèi)屬軟體動(dòng)物門(mén)中的瓣鰓綱（或雙殼綱），常見(jiàn)的螺類(lèi)、蛤類(lèi)、扇貝、牡蠣等都屬于該類(lèi)，貝類(lèi)具有非常高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。由于其生存環(huán)境的復(fù)雜性，使得貝類(lèi)含有很多陸地生物沒(méi)有的具有特殊生理活性的物質(zhì)，含有非常豐富的活性肽和氨基酸等非揮發(fā)性的含氮物質(zhì)[1]。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）一直因?yàn)槠洫?dú)特和重要的生理功能為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所研究，如參與氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、抗氧化作用[2-3]等，目前對(duì)于植物和血漿中的GSH含量的測(cè)定已經(jīng)作出過(guò)很多研究[4-5]，但是關(guān)于貝類(lèi)肌肉中GSH含量的測(cè)定方法研究較少。

游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）是非蛋白氮的重要組成部分，它們對(duì)水產(chǎn)食品新鮮度的評(píng)價(jià)和風(fēng)味的貢獻(xiàn)有非常重要作用，如丙氨酸、谷氨酸以及甘氨酸都會(huì)影響其風(fēng)味以及口感。丙氨酸和谷氨酸具有甜味，谷氨酸尤其在甲殼類(lèi)動(dòng)物肌肉中起重要的鮮味作用[6]。此外，F(xiàn)AA還可作為許多魚(yú)類(lèi)以及甲殼類(lèi)動(dòng)物品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要鮮度潛在指標(biāo)[7-8]。章超樺等[9]在研究翡翠貽貝肉的食品化學(xué)特性時(shí)認(rèn)為呈味FAA對(duì)甜味、甘味有重要貢獻(xiàn)；楊文鴿等[10]通過(guò)對(duì)縊蟶冰藏保活期間呈味物質(zhì)的變化研究發(fā)現(xiàn)FAA對(duì)縊蟶鮮味風(fēng)味起到重要作用，精氨酸能夠賦予海鮮一個(gè)適宜的整體風(fēng)味[11]。關(guān)于植物中游離氨基酸含量的測(cè)定方法為大多國(guó)內(nèi)外學(xué)者所青睞[12-16]，但是關(guān)于貝類(lèi)肌肉中的游離氨基酸卻沒(méi)有一種簡(jiǎn)便快捷的測(cè)定方法。

目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)測(cè)定GSH和FAA的方法有很多，主要有高效液相色譜法[17-21]、比色法[22-26]、毛細(xì)管電泳法[27]、氨基酸自動(dòng)分析（amino acid analyzer，AAA）法[28-31]等。AAA法是最常用的一種分析方法，它是以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為固定相，酸性緩沖液為流動(dòng)相，在柱后采用茚三酮溶液與氨基酸衍生生成具有可見(jiàn)光吸收的衍生物進(jìn)行檢測(cè)，具有重復(fù)性好、儀器穩(wěn)定、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)有的方法主要表現(xiàn)在對(duì)GSH或FAA含量的單獨(dú)測(cè)定，并且貝類(lèi)中GSH或FAA的測(cè)定方法相關(guān)的研究較少，針對(duì)貝類(lèi)肌肉中GSH和FAA的測(cè)定鮮見(jiàn)一種快速、有效的方法。

本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液pH值以及優(yōu)化洗脫程序，建立一種測(cè)定貝類(lèi)肌肉中GSH和FAA的AAA法，同時(shí)對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，確定該方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，為建立貝類(lèi)資源的開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文蛤、青蛤、縊蟶、牡蠣 上海臨港蘆潮港水產(chǎn)市場(chǎng)；運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室立即處理，并于4 ℃條件下保存。

GSH標(biāo)準(zhǔn)品、多種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國(guó)Sigma公司；二水合5-磺基水楊酸（分析純），檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉（均為色譜純），檸檬酸、乙醇、鹽酸（均為優(yōu)級(jí)純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800氨基酸全自動(dòng)分析儀 日本日立公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；501XL全自動(dòng)研磨機(jī) 普瑞科學(xué)儀器公司；BSA124S電子天平 大連格萊瑞機(jī)械有限責(zé)任公司；TopPette手動(dòng)固定移液器、PH-240A干燥培養(yǎng)箱 上海精密儀器儀表有限公司；FRQ-1010HT超聲波清洗器 杭州法蘭特超聲波科技有限公司；GL-26M/MI立式高速冷凍離心機(jī) 上海趙迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標(biāo)液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)量76.83 mg GSH標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定容至100 mL容量瓶中，即得2.5 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中準(zhǔn)確取出2 mL混合溶液，加入2 mL含有多種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸組分（2.5 μmol/mL）的混合液，用超純水定容至50 mL，即為0.10 μmol/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存至4 ℃冰箱。

1.3.2 樣品前處理

樣品處理方法采用Tanimoto等[32]測(cè)定牡蠣在冷藏過(guò)程中FAA的變化為基礎(chǔ)，稍加修改。

準(zhǔn)確稱(chēng)量1 g貝類(lèi)肉組織，加入15 mL 0.02 mol/L稀鹽酸，充分均質(zhì)后用超聲波清洗5 min，然后用冷凍離心機(jī)（5 000 r/min，4 ℃）離心10 min，收取上清液。將剩余殘?jiān)尤?0 mL 0.02 mol/L稀鹽酸后攪拌，再次離心（5 000 r/min，4 ℃）5 min，合并上清液，定容至50 mL。定容后移取2 mL，加入2 mL體積分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸溶液，再次離心（10 000 r/min，4 ℃）10 min，然后經(jīng)0.22 μm水相過(guò)濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。3 組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.3.3 緩沖溶液的配制

緩沖溶液的配制及茚三酮反應(yīng)液的組成如表1、2所示。

表1 緩沖液的配制Table1 Preparation of buffer solution

表2 茚三酮反應(yīng)液的組成Table2 Composition of reaction systems containing ninhydrin

1.3.4 洗脫程序及升溫過(guò)程優(yōu)化

采用氨基酸全自動(dòng)分析儀的梯度洗脫程序在原有基礎(chǔ)上修改，如表3所示。

表3 氨基酸分析儀的梯度洗脫以及升溫程序優(yōu)化Table3 Gradient elution of amino acid analyzer and optimization of heating process

1.3.5 氨基酸自動(dòng)分析儀參數(shù)條件

分離柱（4.6 mm×60 mm），樹(shù)脂為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；分離柱溫度57 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm（脯氨酸為440 nm）；進(jìn)樣量20 μL；緩沖液流速0.35 mL/min；反應(yīng)液：茚三酮試劑，流速0.35 mL/min；單元溫度135 ℃；使用自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 回收率和精密度測(cè)定

各取1 g文蛤肌肉組織，樣品中添加高、中、低3 種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行樣品處理，按照1.3.5節(jié)方法進(jìn)行參數(shù)設(shè)定并上機(jī)檢測(cè)，每種濃度進(jìn)樣5 次，用外標(biāo)法計(jì)算其實(shí)際含量與加標(biāo)平均回收率。

對(duì)同一樣本溶液在1 d內(nèi)進(jìn)行5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)分析日內(nèi)變化，對(duì)同一樣本連續(xù)測(cè)定5 d（每天測(cè)定1 次）的變化，分別確定日內(nèi)與日間精密度。回收率按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品圖譜

L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀的基本原理是以不同pH值梯度的緩沖溶液來(lái)洗脫出（酸性、中性、堿性）FAA，與茚三酮反應(yīng)液會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)，從而對(duì)FAA進(jìn)行定性與定量分析[33]。由于GSH中的氨基在弱酸性溶液中與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物，于波長(zhǎng)570 nm處有最大吸收峰，因此也可以對(duì)此進(jìn)行定性和定量分析。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和4 種貝類(lèi)肌肉樣品圖譜Fig.1 Amino acid profiles of mixed standard solution and muscle samples from four shellfish species

由圖1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和4 種貝類(lèi)肌肉的樣品圖譜在經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，GSH與FAA達(dá)到了較好的分離效果，其中圖1C、D、E中GSH處有其他物質(zhì)干擾，可能為青蛤、縊蟶、牡蠣肌肉中的其他FAA或者活性肽，有待進(jìn)一步的分析與研究。

2.2 方法性能評(píng)價(jià)

通過(guò)線性范圍、檢出限、精密度以及回收率等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)該方法性能[34-35]。

2.2.1 線性范圍、檢出限測(cè)定結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用0.02 mol/L鹽酸溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)蛊滟|(zhì)量濃度分別為1、10、50、100、250 μg/mL，按1.3.5節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液分別進(jìn)樣3 次，通過(guò)保留時(shí)間作為定性的依據(jù)，以所測(cè)色譜的峰面積和其相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，用線性相關(guān)系數(shù)（R2）評(píng)價(jià)[18]；根據(jù)信噪比，當(dāng)所測(cè)物質(zhì)色譜峰的峰高為噪音3 倍時(shí)（RSN=3），確定其混合標(biāo)準(zhǔn)組分的檢出限，當(dāng)色譜峰的峰高為噪音10 倍時(shí)（RSN=10），確定其混合標(biāo)準(zhǔn)組分定量限[36]。

如表4所示，在1～250 μg/mL范圍內(nèi)，GSH和FAA的線性相關(guān)系數(shù)R2在0.999 1～0.999 9之間，表明優(yōu)化過(guò)后的全自動(dòng)氨基酸分析儀法中色譜峰的面積與質(zhì)量濃度之間有著比較好的線性關(guān)系，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的各組分的定量限在0.21～0.94 μmol/L之間，檢出限在0.07～0.27 μmol/L之間。表明優(yōu)化過(guò)后的全自動(dòng)氨基酸分析儀法對(duì)于測(cè)定貝類(lèi)肌肉中的GSH與FAA有著較好的靈敏度。

表4 GSH與多種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table4 Linear correlation coeff i cients, detection limits and quantitation limits of mixed standard solution of glutathione and amino acids

2.2.2 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果

表5 GSH與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)回收率和精確度（n=5）Table5 Recovery and precision of mixed standard solution of glutathione and amino acids (n= 5)

通過(guò)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)以及加標(biāo)回收率的計(jì)算，由表5可知，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各組分加標(biāo)平均回收率在86.40%～102.42%之間，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.31%～0.73%之間，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.14%～2.60%之間，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范中食品理化檢測(cè)[37]的相關(guān)要求。

2.2.3 GSH、氨基酸含量測(cè)定與分析

貝類(lèi)之所以食用起來(lái)口感獨(dú)特，味道鮮美以及營(yíng)養(yǎng)豐富，這其中與GSH以及FAA的含量有著很大的關(guān)系。GSH由于其具有獨(dú)特的生理活性具有抗氧化、抗菌、降血壓等生理功能[3]，F(xiàn)AA則是水產(chǎn)品新鮮度和風(fēng)味的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，也是非蛋白氮的重要組成部分；不同的FAA具有不同的滋味，呈現(xiàn)鮮、甜、酸、苦等多種滋味，會(huì)直接反應(yīng)出水產(chǎn)品食物的味道以及鮮美程度。如甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）主要呈味特性為甜味，為食物本身提供清香的甜味，Glu主要呈味特性為鮮味，是FAA中最重要的鮮味劑，具有保護(hù)肝臟的功能，有著非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及生理功能[38]。

表6 4 種貝類(lèi)肌肉中GSH與FAA的組成及含量（n=3）Table6 Contents of glutathione and free amino acids in four species of shellfish (n=3)

取每種貝類(lèi)肌肉組織各1 g平行做3 個(gè)樣品，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行樣品的處理，并按照參數(shù)條件進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS分析，并得出顯著性，如表6所示。4 種貝類(lèi)肌肉組織中FAA和GSH非常豐富，總FAA含量方面，文蛤含量最高，為1 396.39 mg/100 g，牡蠣為287.01 mg/100 g。總FAA含量為文蛤＞青蛤＞縊蟶＞牡蠣，這與劉云等[39]對(duì)煙臺(tái)近海3 種貝類(lèi)中FAA的測(cè)定結(jié)果略有不同，可能是由于貝類(lèi)在不同地域以及不同生長(zhǎng)環(huán)境的原因?qū)е麦w內(nèi)FAA的含量以及比例存在差異；呈味氨基酸占總FAA的比重較大，其中牡蠣肌肉中呈味氨基酸的含量為143.55 mg/100 g，占總FAA的50.02%，達(dá)到一半的比例；青蛤中呈味氨基酸比例最低，為32.91%；呈味氨基酸含量為文蛤＞縊蟶＞青蛤＞牡蠣；貝類(lèi)肌肉中含有人體必需的大部分氨基酸，縊蟶肌肉中必需氨基酸含量為103.49 mg/100 g，占總FAA的11.36%，牡蠣雖然含量稍低，為54.19 mg/100 g，但比例為18.88%；必需氨基酸含量為縊蟶＞青蛤＞牡蠣＞文蛤，文蛤最低，只有48.15 mg/100 g，占比3.45%。

FAA組成方面，文蛤肌肉組織中主要的FAA為T(mén)au、Glu、Ala、Arg，占FAA含量的比例分別為37.26%、10.55%、32.54%、7.12%，這4 種氨基酸的比例達(dá)到了87.47%，這與Konosu等[40]對(duì)蛤中FAA的組成成分分析結(jié)果相同；青蛤肌肉中主要的FAA為T(mén)au（42.58%）、Glu（11.00%）、Ala（15.12%）、Arg（9.48%）；縊蟶肌肉中主要的FAA為T(mén)au（22.70%）、Glu（5.99%）、Ala（30.47%）、Arg（16.74%），這與楊文鴿等[10]冰藏期間對(duì)縊蟶中FAA含量及比例差別不大；牡蠣肌肉中主要的FAA為T(mén)au（18.89%）、Glu（10.95%）、Gly（19.00%）、Ala（16.94%）、Arg（4.08%），這與Je等[41]測(cè)定牡蠣中主要的FAA結(jié)果相同；通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，貝類(lèi)肌肉中主要的FAA為T(mén)au、Glu、Ala、Arg，占FAA總量中很大的比例，這與Chen Dewei等[42]對(duì)北部灣雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物中FAA的組成測(cè)定的結(jié)果相同。

貝類(lèi)肌肉組織中含有豐富的GSH，和其他水產(chǎn)生物相比含量較高，和陸地生物血液中的含量相當(dāng)，遠(yuǎn)高于植物中的GSH[43]。文蛤、青蛤、縊蟶、牡蠣的含量分別為82.53、103.20、61.77、33.37 mg/100 g；通過(guò)比較得知，青蛤中GSH的含量最高，含量從高到底依次為青蛤＞文蛤＞縊蟶＞牡蠣，這與張靜等[25]利用熒光分光光度法測(cè)定海洋生物中的GSH中含量略有差異，可能由于部分FAA沒(méi)有檢測(cè)出，與GSH的特征峰重疊。由于GSH的獨(dú)特的生理活性和功能，通過(guò)GSH含量的分析也反應(yīng)了貝類(lèi)具有非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.2.4 氨基酸呈味效果及味道強(qiáng)度值分析

味道強(qiáng)度值（taste activity value，TAV）通常是指各種呈味物質(zhì)在樣品中的含量與其相對(duì)應(yīng)的呈味閾值的比值。一般情況下，當(dāng)TAV大于1時(shí)，認(rèn)為該呈味物質(zhì)對(duì)樣品的呈味效果有比較重要的貢獻(xiàn)[44]。相反的，如果TAV小于1，可以判定該呈味物質(zhì)呈味效果不顯著，貢獻(xiàn)不大。

表7 常見(jiàn)貝類(lèi)主要FAA呈味特征、呈味閾值及TAV分析[42]Table7 Taste characteristics, taste threshold and TAV analysis of the main free amino acids in the common shellf i shes

如表7所示，對(duì)文蛤肌肉呈味貢獻(xiàn)最大的是Ala，TAV為7.57，其次是Glu、Arg，TAV分別為4.91、1.99，呈味效果顯著；對(duì)青蛤、縊蟶呈味貢獻(xiàn)較大的為Glu、Ala、Arg，其中青蛤TAV分別為3.73、2.56、1.93，縊蟶TAV分別為1.82、4.63、3.05；對(duì)牡蠣肌肉呈味貢獻(xiàn)比較大的只有Glu，其TAV為1.05，這與楊文鴿等[10]測(cè)定結(jié)果相似；通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)貝類(lèi)呈味貢獻(xiàn)較大的為鮮味和甜味氨基酸，這也是貝類(lèi)具有非常強(qiáng)烈的鮮味以及口感甘甜的重要原因。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以4 種常見(jiàn)貝類(lèi)為研究對(duì)象，采用0.02 mol/L鹽酸溶液作為提取劑，以體積分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸溶液為蛋白沉淀劑，同時(shí)優(yōu)化了緩沖溶液的組成及洗脫程序，采用L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定，可以實(shí)現(xiàn)較好的分離效果，并對(duì)貝類(lèi)肌肉組織中的GSH與FAA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。經(jīng)過(guò)方法學(xué)的驗(yàn)證，該方法具有良好的線性關(guān)系、檢出限、精密度以及回收率，此方法適用于貝類(lèi)肌肉組織中GSH與多種FAA的測(cè)定。

4 種常見(jiàn)貝類(lèi)肌肉中FAA含量比較豐富，文蛤含量最高，為1 396.39 mg/100 g，牡蠣為287.01 mg/100 g。總FAA含量為文蛤＞青蛤＞縊蟶＞牡蠣，呈味氨基酸含量為文蛤＞縊蟶＞青蛤＞牡蠣，必需氨基酸含量為縊蟶＞青蛤＞牡蠣＞文蛤；貝類(lèi)肌肉中主要的FAA為T(mén)au、Glu、Ala、Arg；此外，GSH的含量從高到底依次為青蛤＞文蛤＞縊蟶＞牡蠣，對(duì)4 種貝類(lèi)呈味貢獻(xiàn)較大的鮮味和甜味氨基酸，主要包括Glu、Ala、Arg，這也是貝類(lèi)具有非常強(qiáng)烈的鮮味以及口感甘甜的重要原因。

由于GSH水溶液在常溫條件下容易氧化[45]，在樣品處理過(guò)程中如何防止GSH被氧化，使用何種濃度以及種類(lèi)的抗氧化劑來(lái)保證GSH水溶液不被氧化且不會(huì)影響FAA的含量，有待進(jìn)一步深入研究。此外，本研究只測(cè)定出18 種FAA與GSH的含量，還有部分FAA和活性肽沒(méi)有檢測(cè)出或者特征峰沒(méi)有分離出來(lái)，還有待進(jìn)一步的研究、分離以及優(yōu)化。

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Determination of Glutathione and Free Amino Acids in Muscles of Four Shellf i sh Species by Automatic Amino Acid Analyzer

ZHANG Suping, QIU Weiqiang, LU Qi, CHEN Shunsheng*
(Shanghai Aquatic and Storage Engineering Technology Research, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

An analytical method was established for the simultaneous determination of glutathione and free amino acids in shellf i sh using a fully automatic amino acid analyzer. The extraction of the analytes was carried out using 0.02 mol/L hydrochloric acid solution as the extraction solvent followed by protein precipitation with 5% sulfonic acid solution. The buffer composition and the elution procedure were optimized at the same time. The linear range, limit of detection (LOD), precision and recovery rate of the method were determined. The results showed that good separation of glutathione and free amino acids in shellf i sh was achieved by this method with a good linear relationship. The correlation coeff i cients of the calibration curves were between 0.999 1 and 0.999 9. The minimum LODs at a signal to noise ratio (RSN) of 3 ranged from 0.07 to 0.27 μmol/L. The average recovery rates of spiked samples were between 86.40% and 102.42%. The relative standard deviations (RSDs) of intra-day and inter-day assays were 0.31%–0.73% and 1.14%–2.60%, respectively. Free amino acids were abundant in muscle tissue of four shellf i sh species, and their total free amino acid contents in decreasing order were clam (1 396.39 mg/100 g) ＞ Cyclina sinensis (1 016.04 mg/100 g) ＞ razor clam (911.15 mg/100 g) ＞ oyster (287.01 mg/100 g). The main free amino acids were taurine, glutamic acid, alanine, and arginine. The glutathione contents of Cyclina sinensis, clam, razor clam and oyster were 103.20, 82.53, 61.77, and 33.37 mg/100 g, respectively. This method is suitable for the determination of glutathione and free amino acids in shellf i sh.

shellf i sh muscle; glutathione; free amino acids; automatic amino acid analyzer

10.7506/spkx1002-6630-201704027

TS254

A

1002-6630（2017）04-0170-07

2016-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471685）；上海海洋大學(xué)校科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)（A2-0203-00-100208）；上海海洋大學(xué)校博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（A2-0203-00-100340）

張?zhí)K平（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工和貯藏。E-mail：626038339@qq.com

*通信作者：陳舜勝（1956—），男，教授，本科，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工、食品理化分析和食品感官評(píng)定。E-mail：sschen@shou.edu.cn

張?zhí)K平, 邱偉強(qiáng), 盧祺, 等. 全自動(dòng)氨基酸分析儀法測(cè)定4 種貝類(lèi)肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 170-176. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704027. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Suping, QIU Weiqiang, LU Qi, et al. Determination of glutathione and free amino acids in muscles of four shellf i sh species by automatic amino acid analyzer[J]. Food Science, 2017, 38(4): 170-176. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704027. http://www.spkx.net.cn