響應面試驗優化黏質沙雷氏菌利用菜籽餅粕產靈菌紅素工藝

陳新顏，操麗麗，楊培周,*，王康林，章 華，操新民，鄭 志，姜紹通

（1.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽省農產品加工精深省級實驗室，安徽 合肥 230009；2.平光制藥股份有限公司，安徽 合肥 231131）

響應面試驗優化黏質沙雷氏菌利用菜籽餅粕產靈菌紅素工藝

陳新顏1，操麗麗1，楊培周1,*，王康林2，章 華1，操新民1，鄭 志1，姜紹通1

（1.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽省農產品加工精深省級實驗室，安徽 合肥 230009；2.平光制藥股份有限公司，安徽 合肥 231131）

為篩選得到一株產靈菌紅素的黏質沙雷氏菌為發酵菌種，采用響應面法優化培養基組分和發酵條件，提高黏質沙雷氏菌生產靈菌紅素的效率，結果表明，黏質沙雷氏菌最優培養基組分及發酵條件為玉米粉用量10 g/L、菜籽餅粕用量21.7 g/L、硫酸鋅質量濃度0.05 g/L、發酵液初始pH 5.8、接種量5.5%、裝液量80 mL/250 mL三角瓶、溫度27 ℃、搖床轉速200 r/min，培養24 h后，發酵液中靈菌紅素產量達到11.56 g/L。本研究為高溫菜籽餅粕原料發酵生產靈菌紅素提供理論依據。

黏質沙雷氏菌；靈菌紅素；菜籽餅粕；響應面優化；發酵

油菜籽作為油脂原料，是人類生活和生產的主要食用油來源之一[1]。菜籽餅粕是菜籽油加工的副產品[2]，組分復雜，其中粗蛋白含量占35%～42%；含有的碳水化合物多為不易消化的戊糖，戊聚糖和粗纖維分別占8%和10%～12%；磷、鈣、錳、硒含量高，磷含量中的60%～70%為植酸磷；煙酸和膽堿的含量高；此外，菜籽餅粕含有較多的異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮、硫氰酸酯、腈、單寧、芥子堿、植酸等抗營養因子不但影響日糧的適口性[3]，還易引起動物的甲狀腺腫大[4]，高價值合理利用是解決目前我國菜籽餅粕利用的一個出路[5]。

屬于天然紅色素的靈菌紅素是由黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）表達的次生代謝產物[6]。靈菌紅素具有抗腫瘤、抑制癌細胞增殖[7]和免疫抑制[8]等活性，在一定劑量范圍內表現良好的抗腫瘤及免疫抑制活性，且引起細胞凋亡的作用機制完全不同于當前的臨床藥物，具有潛在的巨大的應用價值和市場前景[9]。研究開始在靈菌紅素發酵生產條件優化方面展開了探索[10-14]，已經報道的發酵原料都屬于化工產品，如乙醇[15]、甘油-丙酮[16]等。以農產品加工副產物特別是利用價值低的副產物菜籽餅粕還鮮有報道。課題組從臭鱖魚腸道內分離出一株產紅色素的黏質沙雷氏菌，通過結構分析鑒定證明該紅色素為靈菌紅素，并對該菌的發酵產靈菌紅素的條件進行初步研究[17]，抑癌實驗表明該靈菌紅素具有強烈抑制人肺癌細胞A549和人乳腺癌細胞MCF-7增殖的功能[18]，具有良好的應用前景。本研究將菜籽餅粕作為營養組分添加到發酵培養基中，通過分析不同組分配方對黏質沙雷氏菌發酵生產靈菌紅素的影響，提高靈菌紅素的產量，同時實現菜籽餅粕高值化利用，為高效低成本生產高附加值的靈菌紅素提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

菜籽餅粕購于安徽肥西油菜籽油加工廠，是高溫壓榨菜籽油的副產物；種子培養基：10 g/L蛋白胨、10 g/L甘油、2 g/L NaCl；發酵培養基：20 g/L菜籽餅粕、10 g/L碳源、2 g/L無機鹽離子。

1.2 儀器與設備

AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器公司；HZQ-F160振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術公司；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器公司；高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo Electric公司；SPX-150B型生化培養箱 上海博訊公司；PHS-25數顯酸度計 上海天達儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 黏質沙雷氏菌生長曲線的繪制

采用比濁法測定菌體含量，取適量發酵液進行10 倍稀釋，以未接種的培養基做等量對照，在波長600 nm處，測定細胞懸浮液的吸光度，在3 個250 mL的三角瓶中分別裝50 mL種子培養基，分別加入活化12 h種子液1 mL，30 ℃、200 r/min培養24 h，每隔1 h測定在波長600 nm處的吸光度，繪制黏質沙雷氏菌的生長曲線。

1.3.2 靈菌紅素標準曲線及靈菌紅素的檢測

配制不同質量濃度的靈菌紅素酸性（pH 3）甲醇溶液（1、2、3、4、5、6 g/100 mL），在535 nm波長處測定吸光度；根據不同質量濃度的靈菌紅素溶液在535 nm處的吸光度，繪制靈菌紅素標準曲線，R2為0.999 7，吸光度和靈菌紅素質量濃度之間的線性關系明顯。取20 mL發酵液離心去除上清液，通過攪拌將沉淀懸浮于甲醇體系中。細胞超聲波輔助浸提（超聲波超聲時間10 s、工作間隙3 s、工作次數7 次、工作最大功率200 W），室溫條件下浸提10 min，收集融入色素的甲醇溶液，反復提取直到甲醇溶液不變色。將收集的甲醇溶液進一步離心，得上清液，調節pH值至3，在535 nm波長處測定吸光度，計算靈菌紅素產量。

1.3.3 工藝優化設計

1.3.3.1 單因素試驗

以靈菌紅素產量為指標，分別考察發酵時間（6、12、18、24、30、36 h）、碳源（蔗糖、玉米粉、紅薯粉、甘油、淀粉、麥芽粉和小麥粉）、菜籽餅粕-玉米粉質量比（1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1）、無機鹽種類（磷酸氫二鉀、硫酸錳、氯化鈣、硫酸鋅、二氯化碳、氯化鈉、磷酸二氫鈉、七水硫酸鎂）、硫酸鋅用量（0、0.05、0.10、0.15、0.25、0.35、0.45 g/L）、發酵溫度（22、24、26、28、30、32 ℃）、搖床轉速（100、150、200、250、300 r/min）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、裝液量（50、60、70、80、90、100 mL）、初始pH值（5.83、6、7、8、9、10）和菜籽餅粕用量（0、5、10、15、20、25、30 g/L）對靈菌紅素產量的影響。單因素試驗是在基本培養條件的基礎上，對各因素進行考察時先固定其他參數，然后對目標因素進行考察，基本培養的設置條件分別為：發酵時間30 h、10 g/L甘油（碳源）、2 g/L NaCl（無機鹽離子）、0.1 g/L硫酸鋅、30 ℃、200 r/min搖床轉速、5%接種量、80 mL裝液量/250 mL、初始pH 7、20 g/L菜籽餅粕（氮源）。

1.3.3.2 Plackett-Burman（PB）試驗

在單因素試驗基礎上選取菜籽餅粕用量、玉米粉用量、搖床轉速、接種量、無機鹽用量、溫度為PB試驗因素，設計六因素PB試驗方案。

1.3.3.3 響應面分析

以PB試驗因素的影響程度為基礎，篩選出3 個影響靈菌紅素產量的主要因素，研究主要因素的最佳水平以及主要因素之間是否存在交互性，通過響應面分析確定最佳的發酵條件。

1.3.4 靈菌紅素的分離純化

在最優發酵條件下提取并純化靈菌紅素，將溶有靈菌紅素的酸性甲醇溶液在70 ℃條件下真空濃縮，取2 倍體積的氯仿對濃縮物進行萃取濃縮。將得到的粗品進行硅膠柱層析，洗脫劑為乙酸乙酯；收集硅膠柱中紅色部分，對收集到的洗脫液進行濃縮，在真空冷凍干燥機中干燥得成品。

2 結果與分析

2.1 黏質沙雷氏菌的生長曲線

黏質沙雷氏菌在0～5 h處于適應期，6～15 h處于對數期，16～18 h進入穩定期，19 h后進入衰亡期。選擇培養12 h的種子液進行接種，這種菌種中后期活性大，適應性強，延滯期短。

圖1 黏質沙雷氏菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Serratia marcescens

2.2 單因素試驗結果

以玉米粉為碳源，配制相同的發酵培養基，獲得的最佳發酵時間為24 h（圖2a）；玉米粉和紅薯粉兩種碳源獲得靈菌紅素產量最大，由于玉米粉的價格便宜，性價比高，碳源選為玉米粉（圖2b）；當菜籽餅粕-玉米粉質量比2∶1時靈菌紅素的產量最高（圖2c）；添加Zn2+的發酵培養基中靈菌紅素的產量比未添加的空白高，其余的離子對產量影響均呈負相關，添加的最優無機鹽為硫酸鋅（圖2d）；高質量濃度的Zn2+對靈菌紅素可能有輕微的抑制效果（圖2e）；發酵最適溫度為26 ℃（圖2f）；當搖床轉速達到200 r/min時，靈菌紅素產量最大，最優轉速為200 r/min（圖2g）；添加5%接種量的發酵培養基靈菌紅素產量最大，最優接種量為5%（圖2h）；裝液量達到80 mL時，靈菌紅素產量達到最大，最優裝液量80 mL（圖2i）；最優pH值為6（圖2j）；最優菜籽餅粕的質量濃度為20 g/L（圖2k）。

圖2 單因素試驗結果Fig.2 Results of one-factor-at-a-time experiments

2.3 影響靈菌紅素發酵產量的PB試驗結果

表1 PB試驗設計與結果Table1 Plackett-Burman (PB) design with experimental values of prodigiosin production

以單因素試驗為基礎，取單因素試驗結果中上升區間的兩個水平設計PB試驗。裝液量：65～80 mL；菜籽餅粕用量：15～20 g/L；玉米粉用量：5～10 g/L；硫酸鋅用量：0.04～0.05 g/L；溫度：22～26℃；接種量：3%～5%；搖床轉速：120～150 r/min，通過軟件處理，得到PB試驗設計（表1）。

試驗處理方差結果見表2，該PB試驗設計模型P值為0.017，該模型顯著，由單因素顯著性可知，B菜籽餅粕用量、E溫度和F接種量的P值均小于0.05，因此，選用這3 個因素設計響應面。

表2 PB試驗方差分析結果Table2 Analysis of variance of the model established based on PB design

2.4 響應面試驗結果

以PB試驗結果為基礎，取PB試驗結果中影響顯著的因素設計響應面試驗（表3）。

表3 響應面試驗設計表與結果Table3 Experimental design and results for response surface methodology

圖3 各因素交互作用的響應面Fig.3 Response surface plots showing the effects of various factors on prodigiosin production

圖3 a中，等高線所圍成的是圓面，溫度與接種量之間的交互影響不顯著，溫度相對于接種量所對應的響應面更加陡，溫度對靈菌紅素產量的影響更大。沿溫度方向向峰值移動的等高線密度明顯大于沿接種量方向向峰值移動的等高線密度，表明溫度對靈菌紅素影響比接種量大。

圖3b中，接種量與菜籽餅粕用量的等高線所圍成的圖形為橢圓形，表明接種量和菜籽餅粕用量對靈菌紅素產量影響交互作用顯著；沿菜籽餅粕用量方向向峰值移動的等高線密度大于沿接種量方向向峰值移動的等高線密度，表明菜籽餅粕用量對靈菌紅素影響比接種量大。

圖3c中，溫度與菜籽餅粕用量的等高線所圍成圖形為近似圓形，表明溫度和菜籽餅粕用量對靈菌紅素產量影響交互作用不是很顯著，沿溫度方向向峰值移動的等高線密度大于沿菜籽餅粕用量方向向峰值移動的等高線密度，表明溫度對靈菌紅素產量影響比菜籽餅粕用量大。

表4 響應面方差分析Table4 Analysis of variance of the response surface model

如表4所示，溫度、接種量和菜籽餅粕用量對靈菌紅素的產量均有極大影響，菜籽餅粕用量與接種量的交互作用對靈菌紅素的產量有一定的影響，這與上述圖形分析中的結果一致。

3 討論與結論

以菜籽餅粕為發酵培養基的組分發酵生產靈菌紅素，影響最顯著的3 個單因素為溫度、接種量和菜籽餅粕用量，其主次順序為：溫度＞菜籽餅粕用量＞接種量，最優發酵條件：溫度27 ℃、菜籽餅粕用量21.7 g/L、接種量5.5%、玉米粉用量10 g/L、搖床轉速200 r/min、pH 6、硫酸鋅用量0.05 g/L、裝液量80 mL/250 mL，在此條件下達到的靈菌紅素最優產量為11.56 g/L，分離純化后的成品如圖4所示。

圖4 靈菌紅素濃縮后（A）冷凍干燥后（B）成品Fig.4 Concentrated fermented broth containing prodigiosin (A) and freeze-dried product (B)

黏質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素過程中存在多種衍生物，包括如十一烷基靈菌紅素等[19]，對靈菌紅素合成的相關基因簇也有相關報道[20-21]。在靈菌紅素合成的發酵條件方面，發酵液中存在的葡萄糖嚴重抑制靈菌紅素的合成[22]，而豆油、棕櫚油、葵花子油等脂肪類碳源[23]以及富含脂肪的花生籽粉、芝麻粉能誘導靈菌紅素合成[24]，甘氨酸[25]、脯氨酸、組氨酸及天冬氨酸能夠作為靈菌紅素合成的中間體，參與靈菌紅素的代謝與合成，此外，部分無機碳也能夠誘導靈菌紅素的合成，如乙醇和甘油等。國內部分學者主要側重于靈菌紅素鑒定及菌種選育[26-28]。在本研究中，由于黏質沙雷氏菌在油脂為底物的發酵中呈粉紅色，而在菜籽餅粕發酵中呈血紅色，盡管菜籽餅粕中存在少量殘留的脂肪酸能夠誘導靈菌紅素的表達，可以確定殘留的油脂并不是本研究中靈菌紅素高產的主因。菜籽餅粕含有較多的如芥子堿、植酸等抗營養因子，對普通微生物生長抑制強烈，大部分細菌、霉菌和酵母都難以在含有菜籽餅粕的培養基中生長。本研究通過以含有抗營養因子的菜籽餅粕為發酵底物，通過優化發酵條件，獲得最優的發酵條件，為利用菜籽加工廢棄物菜籽餅粕生產高價值的醫藥產物靈菌紅素提供依據。

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Response Surface Optimization of Prodigiosin Production of Serratia marcescens Using Rapeseed Meal

CHEN Xinyan1, CAO Lili1, YANG Peizhou1,*, WANG Kanglin2, ZHANG Hua1, CAO Xinmin1, ZHENG Zhi1, JIANG Shaotong1
(1. Anhui Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products, School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Pingguang Pharmaceutical Limited by Share Ltd., Hefei 231131, China)

A culture medium containing rapeseed meal was designed for prodigiosin production by Serratia marcescens. Optimizations of culture medium composition and fermentation conditions by response surface method were performed for improved production of prodigiosin. The results indicated that the optimal medium composition was composed of corn powder 10 g/L, rapeseed meal 21.7 g/L, inoculum concentration 5.5%, and zinc sulfate 0.05 g/L at an initial pH of 5.8. When the strain was cultured for 24 h in 80 mL of the medium contained in a 250 mL fl ask with shaking at 200 r/min, the fermented broth had the highest prodigiosin content of 11.56 g/L. This study could provide a basis for the microbial production of prodigiosin from high-temperature rapeseed meal.

Serratia marcescens; prodigiosin; rapeseed meal; response surface optimization; fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201704037

TS209

A

1002-6630（2017）04-0231-06

陳新顏, 操麗麗, 楊培周, 等. 響應面試驗優化黏質沙雷氏菌利用菜籽餅粕產靈菌紅素工藝[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 231-236. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704037. http://www.spkx.net.cn

CHEN Xinyan, CAO Lili, YANG Peizhou, et al. Response surface optimization of prodigiosin production of Serratia marcescens using rapeseed meal[J]. Food Science, 2017, 38(4): 231-236. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201704037. http://www.spkx.net.cn

2016-04-14

合肥工業大學大學生創新創業訓練項目（201510359056）；安徽省科技攻關項目（1604a0702001）

陳新顏（1994—），男，本科生，研究方向為發酵工程。E-mail：1172149534@qq.com

*通信作者：楊培周（1976—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物和發酵工程。E-mail：yangpeizhou@163.com