強制休眠和嗜水氣單胞菌暴露對兩種不同模式養殖的中華鱉非特異性免疫的影響

邵珠岱

摘要：以仿生態養殖和溫室養殖的中華鱉為研究對象，探討強制休眠和嗜水氣單胞菌暴露對2種模式養成的中華鱉血清非特異性免疫的影響，研究發現，相同條件下，仿生態養殖中華鱉血清T-AOC活性顯著高于溫室養殖中華鱉（P<0.05），溫室養殖中華鱉表現出較高的AKP、ACP活性；強制休眠后的仿生態養殖中華鱉血清SOD、LZM活性極顯著高于溫室養殖中華鱉（P<0.01）；水體中致病性嗜水氣單胞菌脅迫下，兩種模式養殖的中華鱉血清SOD、LZM活性差異不顯著（P>0.05）。結果表明，仿生態養殖中華鱉具有較溫室養殖中華鱉更高的抗病能力。

關鍵詞：中華鱉； 嗜水氣單胞菌； 強制休眠； 非特異性免疫

中華鱉（Pelodiscus sinensis Wiegmann） 屬爬行綱、龜鱉目、鱉科，為我國淡水養殖的重要經濟種類[1]。中華鱉養殖模式主要有溫室養殖、池塘養殖和生態養殖，但一些人工養殖的鱉肉質粗糙、營養品質下降[2]，且病害日趨嚴重，可能是養殖模式的差異為中華鱉生存生長提供了不同的環境條件，環境條件的差異直接影響中華鱉的免疫應答[3-4]。本實驗通過極端環境條件（強制休眠復蘇和嗜水氣單胞菌暴露）對中華鱉血清總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）活性影響的研究，探討養殖模式對中華鱉抗逆性免疫應答的影響，為中華鱉健康養殖提供基礎數據和技術支持。

1材料和方法

1.1實驗動物與致病菌

仿生態養殖中華鱉和溫室養殖中華鱉均購自水產市場，產地青島。仿生態養殖中華鱉體色土黃、體質健壯、無外傷、平均體質量502±49 g，共計21只；溫室養殖中華鱉體色灰黑、體制健壯、無外傷、平均體質量516±54 g，共計21只。

實驗用致病性嗜水氣單胞菌由山東省淡水漁業研究院疫病防控研究室提供，分離自染病鯉魚。

1.2實驗設計

1.2.1強制低溫休眠實驗選擇平均體質量516±54 g的溫室養殖中華鱉9只和平均體質量502±49 g仿生態養殖中華鱉9只，置4 ℃保鮮冰箱中強制休眠48 h后，取出放置室溫（24 ℃）自然恢復其生理機能至正常活動（約2 h）。斷頭取血，4 ℃靜置12 h使血液凝固析出血清（不加抗凝劑），3 000 r/min離心10 min分離血清，置-20 ℃冷凍保存，測定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。

1.2.2致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫實驗選擇平均體質量516±54 g的溫室養殖中華鱉12只和平均體質量502±49 g仿生態養殖中華鱉12只，參考宋理平等[5]方法，進行致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫實驗。將溫室養殖和仿生態養殖中華鱉1∶1放入3個PVC周轉箱（120 cm×80 cm×60 cm，水體100 L），每箱2種中華鱉各4只，在每箱水體中加入10 mL濃度108 CFU/mL的致病性嗜水氣單胞菌，每天維持水體致病菌濃度，養殖7 d后，斷頭取血，4 ℃靜置12 h讓血液凝固析出血清（不加抗凝劑），3 000 r/min離心10 min分離血清，置-20 ℃冷凍保存，測定血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性。

1.3指標測定

血清T-AOC、SOD、LZM、AKP、ACP活性均為送樣至南京建成生物工程研究所，使用相應試劑盒檢測。

1.4數據處理和統計分析

實驗結果用“平均值±標準差”表示，采用SPSS17.0軟件對數據進行單因素方差分析和LSD多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結果與分析

2.1強制低溫休眠恢復時兩種養殖模式中華鱉血清非特異性免疫的對比研究

表1數據顯示，兩種養殖模式下的中華鱉從低溫休眠狀態恢復直正常活動時的血清非特異性免疫能力具有顯著差異，仿生態養殖中華鱉血清T-AOC活性顯著高于溫室養殖中華鱉（P<005），且SOD、LZM活性極顯著高于溫室養殖中華鱉（P<0.01）；溫室養殖的中華鱉血清AKP活性極顯著高于仿生態養殖（P<0.01），ACP活性顯著高于仿生態養殖中華鱉（P<0.05）。

2.2嗜水氣單胞菌暴露脅迫對中華鱉致病性的影響

如表2所示，水體致病性嗜水氣單胞菌脅迫條件下部分仿生態中華鱉背腹部和四肢有少量潰瘍病灶，而溫室養殖中華鱉背腹部和四肢潰瘍灶較多并有一只死亡。

2.3致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫對中華鱉血清非特異性免疫的影響

表3數據顯示，水體中致病性嗜水氣單胞菌脅迫下仿生態中華鱉血清T-AOC活性極顯著高于溫室養殖中華鱉（P<0.01）；兩種養殖方式對中華鱉血清SOD、LZM活性無顯著影響（P>0.05）；溫室養殖中華鱉表現出較高的AKP、ACP活性，其中AKP活性極顯著高于仿生態養殖組（P<0.01）， ACP活性顯著高于仿生態養殖組（P<0.05）。

3討論

機體非特異性免疫體系發揮作用的最直觀體現就是抗病能力。嗜水氣單胞菌是中華鱉的主要致病菌，在已報道的25種中華鱉疾病中有15種是由嗜水氣單胞菌引起的，如紅脖子病、腮腺炎病、紅底板病、白底板病、腐皮病、癤瘡病、穿孔病、爛甲病等[6]。本實驗中在應對7 d的致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫時，2種養殖中華鱉表現出了不同的抗病能力，仿生態中華鱉背腹部和四肢有少量潰瘍病灶，而溫室養殖中華鱉背腹部和四肢潰瘍灶較多并有一只死亡。從形體上看溫室養殖中華鱉背甲較仿生態養殖鱉更凸起，已有畸形的跡象。實驗中溫室養殖中華鱉血清AKP、ACP活性較高，可能就是由于溫室養殖過程中長期的環境脅迫導致骨骼、肝臟、脾臟等已產生病理變化導致。

LZM是吞噬細胞對所吞噬的病原菌能否殺滅的物質基礎[7]，主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解，在受到外來抗原性物質刺激后LZM的活性通常會上升[8]。飼料中添加適量的半胱氨[9]、多糖[10-11]、益生菌[12]等均能提高中華鱉的LZM活性，增強其機體防御能力。SOD是對機體的氧化與抗氧化平衡起到至關重要的作用，能清除超氧陰離子自由基（O2-·），保護細胞免受損傷，從而提高機體的抗氧化功能和防病抗病能力。半胱氨[9]、乳酸菌[12]、綠原酸[13]等免疫增強劑可通過提高抗氧化酶活性來抑制脂質過氧化作用，從而增強中華鱉機體的抗氧化能力。本實驗中，中華鱉低溫休眠恢復時身體的各項機能相對較弱，仿生態養殖的中華鱉表現出極顯著提高的LZM、SOD活性，可有效抵御細菌、活性氧和過氧化物等的侵襲，在機體非特異性免疫體系的恢復中發揮重要作用。

T-AOC的強弱與健康程度存在著密切聯系，T-AOC體系各成份之間相互協同、代償、依賴，主要通過三條途徑形成機體的防御體系：（1）消除自由基和活性氧以免引發脂質過氧化；（2）分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；（3）除去起催化作用的金屬離子。T-AOC更加綜合反映了機體非酶抗氧化系統和抗氧化酶系統共同的抗氧化作用。本實驗中，中華鱉在強制低溫休眠恢復期的免疫應答中，仿生態養殖中華鱉T-AOC活性顯著高于溫室養殖；在致病性嗜水氣單胞菌暴露脅迫時的免疫應答中，仿生態養殖中華鱉T-AOC體系的保護作用更加顯著。因此，仿生態養殖中華鱉具有較溫室養殖中華鱉更高的抗氧化能力，可有效降低養殖過程中病害的危害。

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（收稿日期：2016-10-27）