壬基酚對中華新米蝦幾種生化指標的影響

王建霞+李林鋒+趙文博+王亞欣+孫紹永+趙春龍+王宏偉

中華新米蝦（Neocaridina denticulata sinensis）屬于甲殼綱，十足目，匙指蝦科，米蝦屬。中華新米蝦是一種小型淡水蝦類，具有生長迅速，生命力頑強，對環(huán)境的適應能力較強，生長周期短，容易飼養(yǎng)等優(yōu)點，是一種優(yōu)良的實驗材料。

壬基酚（nonylphenol，NP）被廣泛用于非離子潤滑油添加劑、表面活性劑、洗滌劑等，因而也成為重要的環(huán)境污染物。壬基酚是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有一定的類雌激素樣作用，嚴重影響雄性生物的生殖能力。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年大約有50萬噸的NP進入水體或土壤，被水生生物所攝取并對其產(chǎn)生毒害，NP在其體內(nèi)積累，通過食物鏈對人類造成影響。

根據(jù)文獻[1]報道水體中含有壬基酚的濃度，以20.1 μg/L作為環(huán)境劑量，研究壬基酚對中華新米蝦肌肉內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S轉移酶（GST）、丙二醛（MDA）的作用，通過測定SOD、GST、MDA、蛋白質(zhì)含量，研究壬基酚對水體中中華新米蝦肌肉內(nèi)的酶的毒害作用，進而研究NP對中華新米蝦的影響。

1材料和方法

中華新米蝦采于河北白洋淀，對中華新米蝦進行分組養(yǎng)殖，實驗期為30 d，養(yǎng)殖期間保持養(yǎng)殖水體溫度在23～26 ℃，pH 7.8～8.3，溶氧量>5 mg/L。實驗用自制飼料（飼料配方主要參照Wang H W et al. [2]的實驗飼料配方）。根據(jù)文獻[2]結果，設定環(huán)境中壬基酚的環(huán)境劑量為20.1 μg/L。用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽—S轉移酶（GST）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，按照試劑盒的步驟測定SOD， 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-.），O2-.可將氮藍四唑（NBT）還原為藍色的甲臜（formazan），后者在560 nm處有吸收。SOD可清除O2-.，從而抑制了甲臜的形成。反應液藍色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。測定GST，GST催化GSH與CDNB結合，其結合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340 nm；通過測定340 nm波長處吸光度上升速率，即可計算出GST活性。測定MDA，測定方法是丙二醛在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸（TBA）反應產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3，5，5′-三甲基惡唑2，4-二酮（三甲川），該物質(zhì)在532 nm處有一吸收高峰，并且在660 nm處有較小光吸收。根據(jù)其532 nm的消光值可計算出溶液中丙二醛的含量。

2結果與分析

空白對照組和酒精對照組中由于不含有壬基酚，隨著時間的變化這兩組中SOD活力沒有顯著變化，環(huán)境劑量組中，SOD活力較低，說明水環(huán)境中壬基酚對中華新米蝦SOD有抑制作用；在2倍環(huán)境劑量和5倍環(huán)境劑量中SOD活力隨時間有顯著下降趨勢。而2倍環(huán)境劑量和5倍環(huán)境劑量中SOD活力明顯高于環(huán)境劑量組，說明較高濃度的壬基酚又刺激SOD活力升高來抵御脅迫（見圖1）。

壬基酚對中華新米蝦脅迫實驗中，空白組和酒精對照組，GST活力呈現(xiàn)先降低，10 h又上升的趨勢，說明無脅迫酶活力可以恢復。而在環(huán)境劑量和2倍環(huán)境劑量GST活力下降明顯，說明水環(huán)境中壬基酚對中華新米蝦GST有抑制作用，在5倍環(huán)境劑量中，GST活力總體隨時間也呈下降趨勢，說明一定劑量的壬基酚對中華新米蝦肌肉谷胱甘肽轉移酶活性有脅迫作用，與對照組相比，差異顯著。而5倍環(huán)境劑量明顯高于環(huán)境劑量組和2倍環(huán)境劑量中GST活力，說明較高濃度的壬基酚又刺激GST活力升高來抵御脅迫，而刺激GST提高的濃度略高于刺激SOD提高的壬基酚濃度 （見圖2）。

空白對照組MDA含量遠遠高于其他組（見圖3），說明不同濃度的壬基酚對中華新米蝦中的MDA都有較大影響。

3討論

楊麗麗、方展強[3]的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的壬基酚對唐魚體內(nèi)SOD的含量沒有明顯變化，但是高濃度的壬基酚使唐魚體內(nèi)的SOD含量明顯上升。我們的實驗結果表明中華新米蝦在不高于5倍環(huán)境劑量的條件下，SOD的活力是下降的，這表明壬基酚對中華新米蝦有一定的毒性作用，使其組織損傷，超氧化物歧化酶活力降低。在曹燕花，王茜對小白鼠的研究[4]有類似的發(fā)現(xiàn)，與對照組肝臟SOD的活力、MDA 含量的比較，沒有明顯差異。高劑量組與低劑量組腎臟SOD 活力、MDA 含量比較，差異顯著（P<005），隨染毒NP濃度升高，SOD活力降低，MDA 含量升高。各劑量組子宮NOS 活力比較差異顯著（P<0.05），隨染毒壬基酚濃度升高，NOS 活力下降。結論NP可導致雌性大鼠腎臟SOD 活力降低、MDA 含量升高，且導致子宮中NOS 活力降低，說明壬基酚對腎臟及子宮造成了氧化損傷作用，對肝臟無氧化損傷作用。由此也說明NP主要對生物的生殖系統(tǒng)造成傷害[5]。

GST作為動物體內(nèi)一種重要的解毒酶，能敏感地感覺到環(huán)境中壬基酚的變化。丁秀榮，李正炎對牙鲆的研究[6]表明，低濃度的NP對GST活性的誘導率為127.5%，高濃度的誘導率為373%。本實驗也有類似的結果，當中華新米蝦處于環(huán)境劑量時，GST的活力呈規(guī)律性下降趨勢，當試驗用蝦處于2倍環(huán)境劑量或5倍環(huán)境劑量時，GST活力開始下降。由于NP是一種對生殖系統(tǒng)有毒害作用的物質(zhì)，所以適當?shù)臐舛鹊腘P會激發(fā)生物產(chǎn)生較多的GST來抵抗環(huán)境的變化，但是如果環(huán)境中NP濃度過高超過了生物的耐受能力，那么生物體內(nèi)的GST將降低，通過NP對生物體內(nèi)GST的活力影響，可以檢測環(huán)境中NP污染物的量。

對于MDA的檢驗，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)不規(guī)律狀態(tài)，似乎對后續(xù)實驗沒有任何指導意義，但是參閱了孫建光，王文勇，劉舒婷對金魚的研究[7]發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)上述規(guī)律是正常的，NP對組織中含有的MDA隨著劑量的不同而不同，在一定范圍內(nèi)有著劑量-效應關系。劑量超出一定范圍后，這種關系不再明顯。在時間-效應關系上低劑量組時間效應較弱，高劑量組時間積累效應較強，中劑量組時間積累效應最強。

壬基酚（NP）對于中華新米蝦有很強的毒害作用，能使其肌肉內(nèi)SOD活力明顯下降，并且隨著時間的延長，這種積累會加深。中華新米蝦在環(huán)境劑量組和2倍環(huán)境劑量組中GST活力下降明顯，5倍環(huán)境劑量的實驗用蝦GST活力沒有明顯變化。從時間角度分析，NP使實驗用蝦肌肉內(nèi)GST活力下降。NP對于MDA的影響較大，無論是環(huán)境劑量還是2倍環(huán)境劑量都使實驗用蝦肌肉內(nèi)MDA含量急劇減少。

由于NP是一種對生殖系統(tǒng)有毒害作用的物質(zhì)[8]，所以適當濃度的NP會激發(fā)生物產(chǎn)生較多的GST來抵抗環(huán)境的變化，但是如果環(huán)境中NP濃度過高超過了生物的耐受能力，那么生物體內(nèi)的GST將降低，通過NP對生物體內(nèi)GST的活力影響，可以反映環(huán)境中NP污染物的毒性。

參考文獻：

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[2] Wang HW， Zhao WB， Zhang J， Cai DB， Yin R， Zhang LL， Lu SS， Yang FK. Effects of Nonylphenol on the Enzyme Activity of ERND in Gastropods （Cipangopaludina chinensis） [J]. Advanced Materials Research Vols. 2015，1073-1076，253-255

[3] 楊麗麗，方展強.雌二醇、壬基酚、多氯聯(lián)苯、鎘和鋅暴露對唐魚體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的影響[J].中國實驗動物學報，2012，20（1）：38-45

[4] 曹燕花，王茜，李清釗，等.壬基酚對雌性大鼠肝、腎及子宮的氧化損傷作用[J].環(huán)境與健康雜志，2010，03（27）：233-234

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[6] 丁秀榮，李正炎，王波，等.壬基酚對牙鲆肝臟EROD和GST酶活性的影響[J].中國海洋大學學報，2007，37（sup.）：101-104

[7] 孫建光，王文勇，劉舒婷.壬基酚對金魚丙二醛含量變化率的影響[J].科技信息，2009，33（1）：50-52

[8] Kolanjiappan， K.， Manoharan， S.， Kayalvizhi， M.， 2002. Measurement of erythrocyte lipids， lipid peroxidation， antioxidants and osmotic fragility in cervical cancer patients[J]. Clinica Chimica Acta 326，143-149

（收稿日期：2016-12-05）