響應面法優化超聲波輔助提取白頭翁總皂苷

于爽　郝婧瑋　孫曉薇　高劍　李帥　楊傳偉

摘要：采用響應面法優化了超聲波法輔助提取白頭翁總皂苷（pulsatilla saponin）的條件。以白頭翁皂苷B4提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken響應面分析法，確定最佳提取條件。結果表明，超聲波輔助提取白頭翁總皂苷的最佳工藝參數為超聲功率240 W，乙醇體積分數60%，超聲時間30 min。在此條件下白頭翁皂苷提取得率為5.35%。響應面法優化得到的提取工藝穩定合理，準確可靠，是提取白頭翁皂苷的可行方法。

關鍵詞：白頭翁皂苷（pulsatilla saponin）；超聲波輔助提取；響應面法

中圖分類號：TS229 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0707-05

中藥白頭翁為毛茛科植物白頭翁[Pulsatilla Chinensis（Bge.） Regel]的干燥根，始載于《神農本草經》，其性味苦寒，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲之功效[1，2]。其化學成分有白頭翁皂苷（pulsatilla saponin），胡蘿卜甙，白頭翁素等，主要有效成分為白頭翁三萜皂苷[3，4]。現代藥理研究表明，它具有增強免疫力，抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等作用[5，6]，尤其在抗腫瘤及抗癌的新藥開發方面有很大的應用潛力[7，8]。近年研究還發現其所含的某些活性成分對治療老年性癡呆（阿爾茨海默病）效果顯著[9，10]。

近年來，超聲波技術已經被普遍應用于提取植物中生物活性物質，其具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點。超聲波在液體介質中傳播時，可以在樣品和溶劑間產生特殊的空化作用，超聲波空化時產生的極大壓力可以提高細胞壁的通透性，使細胞內的成分釋放，直接與溶劑接觸并溶解，提高了成分從固相轉移到液相的傳質速率[11-13]。本研究以白頭翁皂苷B4的提取得率為指標，研究了影響白頭翁總皂苷超聲輔助提取效果的各因素，并通過響應面分析法，確定了最佳提取工藝條件，為進一步開發利用白頭翁的藥用價值提供了可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白頭翁飲片，產地東北，購自藺氏盛泰藥業有限公司；白頭翁皂苷B4標準物質（貴州迪大生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀（Waters公司）；Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；JAC-600超聲波中藥處理機（山東濟寧超聲電器有限公司）；色譜柱（4.6 mm×150 mm）；BSA2245S-CW電子分析天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；FZ102微型植物粉碎機（江東精密儀器公司）；自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Shimadzu VP-ODS （4.6 mm×150 mm，4.6 μm），流動相為乙腈-水-磷酸（27∶73∶0.1，v/v），等度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，檢測波長為201 nm，柱溫為25 ℃，進樣體積10 μL，收集時間為17.201 min，定量方法為外標工作曲線法。

1.2.2 標準曲線方程 精密稱取白頭翁皂苷B4標準品3.00 mg置于5 mL容量瓶中，加入無水甲醇溶液定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，將白頭翁皂苷B4標準品母液依次梯度稀釋為0.300、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL，按上述色譜條件測定峰面積，以質量濃度（mg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。以峰面積Y和皂苷含量X進行線性回歸，得到回歸方程為Y=2 586.4X-26.734，r=0.999 6，白頭翁皂苷含量在0.025～0.600 mg/mL。

1.2.3 樣品中白頭翁皂苷的測定 將白頭翁根粉碎，過50目篩，準確稱取5.00 g按一定的料液比，分別加入一定濃度的乙醇溶液，設定超聲功率和超聲時間進行提取，提取完畢后，濾液4 000 r/min離心10 min，取上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，精密吸取各供試品溶液10 μL，按上述給定的條件測定峰面積，以回歸方程計算含量。

Y=CV/M×100%

式中，Y為提取得率；C為白頭翁皂苷B4濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；M為原料質量（mg）。

1.2.4 超聲波輔助提取白頭翁皂苷的單因素試驗 分別選取不同的粒徑大小、乙醇體積分數、料液比（g/mL，下同）、超聲時間、超聲功率和超聲次數進行單因素試驗，考察各單因素對白頭翁皂苷提取得率的影響。

1.2.5 響應面分析法優化白頭翁皂苷的提取條件 在單因素試驗的基礎上，進一步考察超聲功率、乙醇體積分數、提取時間對白頭翁皂苷提取效果的影響，利用Box-Behnken來設計試驗，根據中心組合試驗設計原理，以白頭翁皂苷提取得率為響應值，采用3因素3水平的響應面分析法，對超聲提取條件進行優化，因素水平見表1。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助法提取白頭翁皂苷的單因素試驗

2.1.1 粒徑大小對白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖1可見，白頭翁粉末顆粒越小，白頭翁皂苷提取得率越高。當達到50目的粒徑時，白頭翁皂苷提取得率可達到5.19%，雖然60目的粒徑，白頭翁皂苷提取得率會略有增加，但樣品過于細小會將其他的糖等物質溶出，不利于后續試驗的進行，故選擇50 目的白頭翁粉末。

2.1.2 料液比對白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖2可見，當料液比為1∶8時，白頭翁皂苷的提取得率可以達到最大，溶劑的量再繼續增加，白頭翁皂苷提取得率反而下降，其原因可能是當溶劑用量增大到一定程度時，超聲波能量過多的作用于溶劑，影響了白頭翁皂苷提取得率，故料液比確定為1∶8。

2.1.3 乙醇體積分數對白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖3可見，增大乙醇體積分數，白頭翁皂苷提取得率呈上升趨勢，乙醇體積分數為60%時，皂苷提取得率達到最大值5.33%，當體積分數繼續增加，皂苷提取得率反而呈下降趨勢。可能原因是過高的乙醇體積分數使得細胞壁處于收縮狀態，阻礙了皂苷的溶出，故確定60%為乙醇的最佳體積分數。

2.1.4 超聲功率對白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖4可見，隨著超聲功率的增加，白頭翁皂苷提取得率呈上升趨勢，超聲功率為60%（240 W）時，皂苷提取得率達到最大值5.33%，當超聲功率超過60%（240 W）時，皂苷提取得率開始下降。因此確定超聲提取功率為60%（240 W）。

2.1.5 超聲時間對白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖5可見，隨著超聲時間的延長，白頭翁皂苷的提取得率先升高后降低，在30 min時得率達到最高為5.24%；30 min后皂苷的得率降低，原因可能是白頭翁皂苷分子的化學鍵等被持續的超聲波破壞，甚至是斷裂，得到了其他產物，所以確定超聲提取時間為30 min。

2.1.6 超聲次數對白頭翁皂苷B4提取得率的影響 由圖6可見，隨著超聲次數的增加，白頭翁皂苷提取得率呈上升趨勢，且在第2次提取時增加明顯，進一步增加超聲次數，白頭翁皂苷提取得率有所提高但不顯著，考慮降低能耗及成本、節約溶劑，確定提取2次為宜。

綜上所述，根據單因素條件試驗，初步選定過 50目的白頭翁粉末料液比1∶8，乙醇體積分數60%，超聲功率240 W，超聲時間30 min，超聲次數2次為最佳提取條件，采用響應面法對超聲輔助提取白頭翁皂苷工藝條件進行優化。

2.2 響應面優化超聲輔助溶劑提取白頭翁皂苷

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析分析 超聲功率（A）、乙醇體積分數（B）、超聲時間（C）3個因素對白頭翁皂苷得率（Y）的影響，采用響應面進行試驗設計。試驗設計及結果如表2。將所得試驗數據通過軟件Design expert 7.0進行多元回歸擬合，白頭翁皂苷提取得率與超聲提取各因素變量的二次回歸方程模型為：

Y=5.220+0.140A-0.096B+0.150C-0.200AB-0.089BC-0.470A2-0.560B2-0.630C2

根據回歸方程模型及試驗數據對其各項進行方差分析（表3）。由表3可知，二次回歸方程模型可達到極顯著（P<0.01）水平，其中，失擬項F=5.26（P>0.05）且誤差小，表明該方程模型對試驗數據處理及分析的結果有效可靠，決定系數為0.918 5，說明該模型的解釋程度較高，可以反映出91.85%的響應值變化，擬合精度較好，可以預測白頭翁皂苷的不同提取條件。根據各因素的F值比較可知，影響程度最大的因素是C，其次為B，A的影響程度相對較小。一次項（A、C）交互項（AB）對結果有著顯著影響（P<0.05），二次項（A2、B2、C2）對結果影響極顯著（P<0.01）。

2.2.2 響應面圖分析 響應面圖形是反映響應值與各個試驗因素之間變化的三維圖形，可從中分析出參數與最佳參數間的相互作用關系，測試因素間的交互作用關系由等高線的形狀反映，若兩因素相互作用顯著則呈現橢圓形。當其形狀越向圓形趨近時，交互作用越弱。如果為標準圓形，可認為這兩因素之間的相互作用可忽略不計。由圖7-圖9可以看出，超聲功率（A）、乙醇體積分數（B）、超聲時間（C）3個因素與白頭翁皂苷的提取得率（Y）呈拋物線關系，在自變量A、B、C的取值范圍內，Y有著相應的極高值與其對應。

3 提取工藝條件的確定

為進一步確定最佳工藝點，在模型濃度范圍內選擇出發點，按照模型使用快速上升法進行優化，可得最佳理論工藝條件為超聲時間29.35 min，超聲功率59.08%，乙醇體積分數60.95%。考慮到實際應用，將提取工藝參數修正為超聲時間30 min，乙醇體積分數為60%，超聲功率為60%（240 W），白頭翁皂苷提取得率達到5.45%，與理論值接近。因此，基于響應面法所得的優化提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

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