液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法探討

嚴(yán)小莉高靜賢劉茜王莎莎楊宇民

液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法探討

嚴(yán)小莉1高靜賢1劉茜1王莎莎1楊宇民2

目的 應(yīng)用浸提液試驗(yàn)（MTT比色法）和直接接觸試驗(yàn)兩種方法對(duì)液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)。方法 考慮到液體創(chuàng)口貼的有效使用狀態(tài)為成膜制品，故將液體創(chuàng)口貼室溫下成膜于培養(yǎng)皿上再加入細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行浸提。結(jié)果 這兩種試驗(yàn)方法在低濃度（0．125 g/皿、0．2 5 g/皿和0．5 g/皿）時(shí)結(jié)果基本一致，而高濃度（1 g/皿和2 g/皿）時(shí)差異較大。結(jié)論 在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，需明確檢驗(yàn)方法及樣品濃度。

液體創(chuàng)口貼；細(xì)胞毒性；直接接觸法；MTT比色法

液體創(chuàng)可貼是近年來(lái)新出現(xiàn)的有別于傳統(tǒng)繃帶創(chuàng)可貼的新型創(chuàng)可貼。由于液體創(chuàng)口貼是直接與傷口創(chuàng)面接觸的，故需對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)[1]。而體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單、易標(biāo)準(zhǔn)化、周期短、敏感性強(qiáng)且能定量分析等優(yōu)點(diǎn)，是醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)體系中最重要的檢測(cè)指標(biāo)之一[2]?，F(xiàn)選擇了兩類細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法：浸提液試驗(yàn)（MTT比色法）和直接接觸試驗(yàn)，依據(jù)GB/T16886.5-2003和ISO 10993.5-2009標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行了試驗(yàn)[3-5]。浸提液試驗(yàn)是目前檢測(cè)中最常用的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，但是在GB/T 16886.12-2005和ISO 10993.12-2012中只規(guī)定了固體類材料的樣品浸提制備方法，對(duì)于液體類的沒(méi)有明確的規(guī)定[6-7]。而浸提液的制備對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響是非常大的，試驗(yàn)中考慮到液體創(chuàng)口貼的有效使用狀態(tài)為成膜制品，故讓液體創(chuàng)口貼室溫下成膜后再加入細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行浸提。通過(guò)兩種試驗(yàn)方法的比較對(duì)液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)細(xì)胞選取L929小鼠成纖維細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。主要藥品與試劑：RPMI1640培養(yǎng)液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。液體創(chuàng)口貼隨機(jī)取樣于同一廠家送檢的同批次產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 直接接觸法 分別取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液體創(chuàng)口貼置于培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使其均勻鋪于培養(yǎng)皿中，室溫晾干后，分別加入10 ml濃度為1×104U/ml的細(xì)胞懸液，取空白培養(yǎng)皿作為陰性對(duì)照，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h、48 h和72 h取出培養(yǎng)皿，置倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.2.2 四唑鹽（MTT）比色法 分別取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液體創(chuàng)口貼置于培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使其均勻鋪于培養(yǎng)皿中，室溫晾干后，分別加入10 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。置于37℃放置24 h制備浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作為陰性對(duì)照品；5%的DMSO溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。將培養(yǎng)至近匯合的L-929細(xì)胞消化，稀釋為1×104U/ml的細(xì)胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除每孔中原培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組加新鮮培養(yǎng)液200 μl，各組分別加樣品浸提液、陰性與陽(yáng)性對(duì)照樣品浸提液200 μl，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后將培養(yǎng)板取出，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后移除孔內(nèi)液體，加入200 μl DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，選擇570 nm在ELX800UV型酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度（optical density，OD）值，按公式計(jì)算相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件包Statistica對(duì)數(shù)據(jù)作Students’t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用（Mean±SEM）表示，確定差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 直接接觸法

共培養(yǎng)24 h后，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細(xì)胞能貼壁于膜上生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)條梭形或不規(guī)則多邊形，1 g/皿和2 g/皿的細(xì)胞變圓或裂解死亡，未能貼附生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細(xì)胞大量增殖，共培養(yǎng)72 h后，0.125 g/皿和0.25 g/皿兩組視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量差別不大，0.5 g/皿組的細(xì)胞數(shù)量較之前兩組較少，1 g/皿和2 g/皿的細(xì)胞已死亡殆盡，見圖1。

2.2 MTT（四唑鹽）比色法

表1為各浸提比例浸提液的細(xì)胞相對(duì)增殖率。結(jié)果顯示：隨著浸提比例的增加，細(xì)胞的相對(duì)增殖率越來(lái)越低。

3 討論

液體創(chuàng)可貼屬于生物成膜型生物制品，將其噴涂或涂抹在創(chuàng)面能快速干燥并形成透氣、防水、柔軟且有彈性的保護(hù)膜。它具有隔菌、透氣、防水、使用方便、易于觀察傷口情況及促進(jìn)傷口恢復(fù)等特點(diǎn)[8]。不含藥物的液體創(chuàng)可貼屬于醫(yī)療器械范疇，按照國(guó)家醫(yī)療器械的分類規(guī)則，其屬于Ⅱ類醫(yī)療器械產(chǎn)品[9]。國(guó)家對(duì)Ⅱ類醫(yī)療器械產(chǎn)品是進(jìn)行注冊(cè)管理的。在現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，還沒(méi)有針對(duì)液體創(chuàng)口貼的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。目前其在注冊(cè)申請(qǐng)時(shí)都是依據(jù)企業(yè)提供的產(chǎn)品技術(shù)要求或是委托書進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。隨著此類產(chǎn)品申請(qǐng)注冊(cè)企業(yè)的增多，為保證其使用的安全性，建立合適的檢驗(yàn)方法體系進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)是必要的步驟。而體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是生物學(xué)評(píng)價(jià)中不可或缺的一項(xiàng)試驗(yàn)，是評(píng)價(jià)醫(yī)療器械產(chǎn)品毒性反應(yīng)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

試驗(yàn)中選擇了直接接觸法和浸提液法對(duì)液體創(chuàng)口貼的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測(cè)。在進(jìn)行浸提液制備時(shí)，如果將液體創(chuàng)口貼直接加入細(xì)胞培養(yǎng)液制備浸提液，會(huì)形成絮狀物，無(wú)法進(jìn)行試驗(yàn)。考慮到它的有效使用狀態(tài)為成膜制品，故在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)都是將其先晾干成膜，再進(jìn)行檢測(cè)。

GB/T16886.5-2003標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了直接接觸法的試驗(yàn)步驟：是將細(xì)胞培養(yǎng)到近匯合的狀態(tài)，再將樣品置于細(xì)胞上方，共培養(yǎng)后觀察樣品下方以及周圍細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)行分類分級(jí)。本試驗(yàn)中由于樣品成膜后較輕，如果將膜置于細(xì)胞上方會(huì)漂浮在培養(yǎng)液中，無(wú)法固定，從而無(wú)法進(jìn)行后期觀察。故在進(jìn)行本試驗(yàn)時(shí)，是將液體創(chuàng)口貼直接成膜貼附于培養(yǎng)皿中，再將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中。結(jié)果顯示：0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細(xì)胞能貼壁于膜上生長(zhǎng)，且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量也增加，這與MTT比色法的結(jié)果一致。1 g/皿和2 g/皿組在直接接觸法中細(xì)胞在24 h未能貼附生長(zhǎng)就已死亡殆盡，但在MTT比色法中這兩組細(xì)胞增殖率分別為54.6%、40.4%。這兩組結(jié)果直接接觸法的細(xì)胞毒性高于MTT比色法，分析原因可能是MTT比色法中細(xì)胞是貼附生長(zhǎng)后再加的浸提液，因而浸提液中的毒性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的增殖影響較大，對(duì)細(xì)胞的貼壁影響不大；直接接觸法是細(xì)胞懸液直接加入到膜上，樣品釋放的毒性物質(zhì)使得細(xì)胞不能貼壁，也就不能增殖生長(zhǎng)。

表1 各浸提比例浸提液的細(xì)胞相對(duì)增殖率

圖1 L-929細(xì)胞與各比例的液體創(chuàng)口貼膜共培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后的細(xì)胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×400）

綜合這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，這兩種細(xì)胞毒性檢測(cè)方法都能適用于液體創(chuàng)口貼的檢測(cè)。但由于這兩種檢測(cè)方法的原理不同，對(duì)檢測(cè)結(jié)果也有很大的影響。而且樣品濃度的選擇也會(huì)直接影響檢測(cè)的結(jié)果。此外，國(guó)內(nèi)液體創(chuàng)可貼尚未有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制，都是企業(yè)內(nèi)部技術(shù)要求，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，需要制定相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理控制?，F(xiàn)行的國(guó)際、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)只是對(duì)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)給出了籠統(tǒng)的指導(dǎo)原則，并沒(méi)有實(shí)際的針對(duì)性[10]。因此在實(shí)際的醫(yī)療器械檢測(cè)過(guò)程中，需要我們檢測(cè)人員根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的特性，探尋出合理有效地檢測(cè)方法，以期達(dá)到有效地評(píng)價(jià)醫(yī)療器械產(chǎn)品細(xì)胞毒性的目的。

[1] GB/T16886．1-2011． 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第1部分風(fēng)險(xiǎn)管理過(guò)程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)[S]． 2011．

[2] 高靜賢，王莎莎，金夢(mèng)，等． 醫(yī)用超聲耦合劑體外細(xì)胞毒性檢測(cè)的探討[J]． 中國(guó)醫(yī)療器械雜志，2013，37（3）：210-212．

[3] GB/T16886．5-2003． 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[S]． 2003．

[4] ISO 10993-5：2009． Biological evaluation of medical devices-Part 5：Test for in vitro cytotoxicity[S]． 2009．

[5] 奚廷斐． 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[M]． 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012：96-107．

[6] GB/T 16886．12-2005． 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分:樣品制備與參照樣品[S]． 2005．

[7] ISO 10993-12：2012． Biological evaluation of medical devices -Part 12：Sample preparation and reference materials[S]． 2012．

[8] 劉海霞，張愛軍，張林． 液體創(chuàng)可貼的研究進(jìn)展[J]． 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2016，6（4）：28-31．

[9] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局． 醫(yī)療器械分類規(guī)則（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第15號(hào)）[S]． 2015．

[10] 孫皎． 醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)價(jià)與風(fēng)險(xiǎn)探討[J]． 中國(guó)醫(yī)療器械雜志，2006，30（5）：386-387，382．

Discuss the Vitro Cytotoxicity Test of Liquid Bandage

YAN Xiaoli1GAO Jingxian1LIU Qian1WANG Shasha1YANG Yumin21 Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute, Nanjing Jiangsu 210022, China; 2 Key Laboratory for Nerve Regeneration, Nantong University, Nantong Jiangsu 226000, China

Objective The cytotoxicity of liquid bandage was tested by MTT assay and direct contact. Methods Considering the using condition of liquid bandage, the sample was prepared to make extraction on the film formation. Results The results of the two tests were consistent at 0.125 g/plate, 0.25 g/plate and 0.5 g/plate. At 1 g/plate and 2 g/plate, significant different appeared in the tests. Conclusion The experimental condition and the preparative method of extraction should be determined.

liquid bandage; cytotoxicity; direct contact test; MTT assay

R446

A

1674-9316（2017）04-0112-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．04．071

國(guó)家自然科學(xué)基金課題（81371687）

1 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，江蘇 南京 210022；2 南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226000