十堰市苯丙酮尿癥兒童苯丙氨酸羥化酶基因突變檢測研究

易燕 劉芳 柴艷婷 紀宏先 李珍

·調查研究·

十堰市苯丙酮尿癥兒童苯丙氨酸羥化酶基因突變檢測研究

易燕 劉芳 柴艷婷 紀宏先 李珍

目的 分析十堰市苯丙酮尿癥(PKU)患兒苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因的突變特點，以指導產前診斷。方法 納入2012年1月至2015年12月十堰市確診的PKU患兒15例為研究對象，應用PCR產物直接測序法，檢測患兒PAH基因全部外顯子及其啟動子區域序列。結果 30個PAH等位基因中，突變基因出現19個，占63.3%，類型共10種。突變類型主要為R243Q、R241C、Y365X、R111X，其余均為散在發生突變，對比國內外文獻及PAH相關國際數據庫，未見新的基因突變類型。結論 十堰市PAH基因突變具有多樣性和復雜性，R243Q、R241C、Y365X、R111X為其主要突變位點。

苯丙酮尿癥；兒科；苯丙氨酸羥化酶；基因突變

苯丙酮尿癥(PKU)為常染色體隱性遺傳病，由苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因突變，導致PAH活性降低或喪失，使苯丙氨酸在體內大量積蓄所致[1]，該疾病可影響神經系統發育，導致嚴重的智力低下及神經行為異常[2,3]。早期診斷、及時治療是降低疾病影響的重要措施[4,5]，因此明確患兒PKU基因的突變特點，提升基因診斷效果有重要意義。該疾病的發病有顯著的種族及地域差異[6]，本研究重點探討了十堰市患兒PAH基因突變特點，旨在提升該疾病的早期診斷、遺傳咨詢和孕前干預效果，報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入對象共15例，均為2012年1月至2015年12月十堰市新生兒疾病篩查中心篩查確診或門診就診后確診的經典型PKU患兒，患兒監護人均對本研究知情同意。患兒年齡20 d～5歲,平均(2.2±0.7)歲，戶口在我市且至研究結束時未變動，初診時血清苯丙氨酸濃度274～2 710 μmol/L、平均(1 857.6±582.4)μmol/L，患兒均經尿喋吟分析排除四氫生物喋吟缺乏癥。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器:全血基因組DNA提取試劑盒、2×RCR Master Mix、DNA純化試劑盒，均購自北京天根生物技術有限公司；Chelex-100，購自Biorad；引物合成，由上海生工生物技術有限公司提供；PCR擴增儀、基因測序儀，購自ABI。

1.2.2 DNA提取:采用全血基因組DNA提取試劑盒進行：①將經EDTA抗凝處理的200 μl全血置入1.5 ml 離心管，加入20 μl蛋白酶K，混勻后加入200 μl 緩沖液GB，顛倒混勻并放置10 min，使溶液變清涼，隨后加入200 μl無水乙醇，顛倒混勻；②所得混合液置入吸附柱CB3，以12 000 r/min速度離心30 s，棄廢液，吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD，同條件離心30 s，棄廢液；③吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，同條件離心30 s，棄廢液，重復1次；④吸附柱CB3再次同條件離心2 min，棄廢液后室溫放置，晾干殘留漂洗液；⑤吸附柱CB3轉入新的離心管，向吸附膜中間加入50～200 μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2～5 min，以12 000 r/min速度離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.2.3 引物設計:應用Primer5設計13對引物，分別用于擴增PAH基因1-13外顯子及側翼序列，引物區域、序列及擴增片段長度見表1。

1.2.4 PCR擴增及測序:在ABI 9700型擴增儀上進行PCR反應，總反應體積20 μl，包括1.5 U Taq DNA聚合酶，引物濃度2 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L。先設定95℃預熱，持續15 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，此加熱方案共持續20個循環，且每個循環退火溫度下降0.2℃；第20個循環結束后，以94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，此加熱方案共持續15個循環；最后72℃延伸，持續5 min。產物接受2%瓊脂糖凝膠電泳、后續測序反應。產物直接測序，樣品純化及分析均由中國優生優育基因科學專家指導中心完成。

表1 PAH基因全長外顯子擴增引物序列及擴增片段長度

2 結果

2.1 患者PAH基因測序結果 15例納入患兒中，6例檢出2個突變基因位點，包括1例純合突變，7例檢測1個突變基因位點，2例未檢測出基因突變位點。見表2。

2.2 PAH基因突變類型及分布頻率 在本研究所檢測的30個等位基因中，共發現19個突變基因，檢出率63.3%。此19個突變基因共包括10種突變類型，其中錯義突變5種、無義突變3種、缺失突變1種、剪切位點突變1種。R241C、Y356X突變頻率最高，均為13.3%，其次為R243Q，為10.0%，再次為R111X，為6.7%，且為純合突變，其余均為散在發生。經科技查新、查閱國內外文獻、查詢PAH專業網站及數據庫，證實未見新的PAH基因突變類型。見表3。

3 討論

PKU是少數可治的遺傳代謝性疾病之一[7-9]，早期發現、早期診斷、早期治療能夠有效改善患兒預后，使患兒智能及神經功能發育接近正常人。該疾病形成的分子基礎是PAH基因突變，導致的PAH結構及活性變化。報道指出，PAH基因的突變點多位于編碼區，只引發一個或多個氨基酸改變，突變對酶活性的影響程度有差異，主要取決于突變的類型和位點[10]。受基因檢測技術的發展影響，PKU的診治效果顯著提升，早期檢測PAH基因突變能夠對早期診治、遺傳咨詢及孕前干預均有積極作用，研究證實PAH基因突變存在明顯的種族和地域分布差異[11-13]，國內報道的突變種類有100余種，且還在不斷上升，但有關十堰市的PAH突變基因卻少有研究報道，這不利于本地區PKU的控制，本研究則有助于彌補此方面空白。

表2 患兒PAH基因測序結果

表3 患兒PAH基因突變及構成

本研究報道的15例PKU患兒中，共檢測出10種、19個基因突變類型，主要表現為R243Q、R241C、Y365X、R111X突變，提示十堰市開展PKU產前基因診斷或進行相關基因突變研究時，需要重點關注上述突變，這與國內其他報道既有相似性也有差異性。如強榮等[14,15]報道陜西地區PAH基因突變類型中，R243Q為特點突變，但其突變檢出率89.10%，高于本研究；朱文斌等[16,17]報道福建地區主要PAH基因突變型也包括R241C，但其他還包括R408C、EX6-96A>G，這與本研究結果不同。本研究患兒致病基因突變廣泛存在于PAH基因的第3、7外顯子上，而既往報道顯示日本人主要集中在第6、7、12外顯子，歐洲人更多集中于第3、10、12外顯子[18-20]，這表明十堰市PAH基因突變存在高度異質性；對比國內部分研究，可見十堰市PAH基因突變涉及的外顯子與寧夏、蘇州地區存在一定差異性，表明國內不同地區PKU患兒PAH基因突變分布也存在明顯差異。但本研究并未發現與國際國內既往報道不同的新型PKU基因突變類型，這提示十堰市PAH基因突變又與其他地區存在一定相似性。

基因突變檢出率的差異除受到檢測方案的影響外，可能還提示本地部分患兒突變基因可能出現于PAH基因的13個外顯子之外區域；或其致病機制并非PAH基因突變，而可能涉及到基因表達的順式作用元件、反式作用因子、啟動子、增強子等因素。

綜上所述，十堰市PKU兒童PAH基因突變存在一定地域特征，具備一定的多樣性與復雜性，目前所知的主要突變種類為R243Q、R241C、Y365X、R111X，掌握其特征對PKU的早期診治、遺傳咨詢及孕期檢查有一定作用。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.02.042

442000 湖北省十堰市婦幼保健院

劉芳，442000 湖北省十堰市婦幼保健院；

E-mail：984489965@qq.com

R 725.893

A

1002-7386(2017)02-0300-03

2016-06-09)