芒花粉活力及柱頭可授性研究

孫扣忠，胡 彬，蔣建雄,3

(1.鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，江蘇 鹽城 224049； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院/生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

芒花粉活力及柱頭可授性研究

孫扣忠1，胡 彬2，蔣建雄2,3

(1.鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，江蘇 鹽城 224049； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院/生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

采用I2-KI染色法和離體萌發(fā)法測定芒(Miscanthussinensis)花粉活力以及不同保存條件下的花粉壽命，并利用H2O2法檢測雌蕊柱頭的可授性。結(jié)果表明：芒花粉量大，平均花粉量/胚珠比(P/O值)達(dá)到5445±2883，屬于專性異交性植物，且花粉初始活力較高，平均為78.68%±17.46%，但離體花粉的活力喪失快，室溫干燥和濕潤條件下保存的花粉壽命分別為70 min和100 min。不同基因型在花粉量、花粉活力及壽命上存在變異。雌蕊柱頭可授性較高，活性可持續(xù)8 d，最佳授粉期為開花前1 d至開花后1 d。

芒；花粉活力；柱頭可授性；P/O值

芒屬(Miscanthus)植物為禾本科C4類多年生高大草本纖維素類植物，主要分布在東亞、東南亞和太平洋群島等地區(qū)，我國是世界芒屬植物資源的分布中心[1-3]。芒屬植物具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，可用于造紙、制藥、水土保持和生態(tài)修復(fù)等[4-5]。近年來，芒屬作為一種具有重要開發(fā)利用前景的能源植物而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[6]。芒(Miscanthussinensis)是芒屬的一個(gè)廣布種，在日本、朝鮮半島以及我國從吉林南部到海南三亞等地區(qū)均有分布，其類型多樣，蘊(yùn)藏著豐富的基因資源，是目前在歐美地區(qū)被廣泛研究和栽培的優(yōu)良三倍體自然雜交種M.xgiganteus的親本種之一[7-9]。

傳粉是植物授粉受精過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，花粉粒由傳粉媒介(昆蟲、風(fēng)或其他媒介)傳送到雌蕊柱頭而完成傳粉過程。為保證授粉成功，必須使花粉在具有生活力時(shí)到達(dá)適宜的柱頭。因此，植物花粉活力與柱頭可授性評價(jià)是繁殖生物學(xué)的重要研究內(nèi)容[10-11]。目前國內(nèi)外對于芒的繁殖生物學(xué)研究鮮有報(bào)道，嚴(yán)重限制了對該類植物資源的開發(fā)利用。因此，通過對芒的花粉活力以及柱頭可授性開展系統(tǒng)的研究，旨在闡明該物種的繁殖生物學(xué)特征，為進(jìn)一步開展芒的遺傳學(xué)分析和遺傳改良方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集野外的芒種質(zhì)資源，其原產(chǎn)地信息見表1。采集根狀莖種植于試驗(yàn)圃中，進(jìn)入盛花期后取樣進(jìn)行測定分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉活力測定 I2-KI染色法[12]測定不同基因型芒花粉活力以及花藥散粉后不同時(shí)段的花粉活力變化情況，每隔2 h取樣測定1次。散粉當(dāng)天采集花粉，置于載玻片上，加1～2滴I2-KI溶液，在Olympus普通光學(xué)顯微鏡(100×)下觀察，花粉粒顯現(xiàn)藍(lán)黑色即為有活力。每次隨機(jī)觀測100個(gè)花粉粒，計(jì)算染色百分率，3次重復(fù)，取平均值。

離體萌發(fā)法 參考Brewbaker & Kwack液體培養(yǎng)基配方[13]，并在此基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)：A 無機(jī)鹽母液：HBO30.1 g，Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KNO30.1 g，加蒸餾水至100 mL。

B 應(yīng)用培養(yǎng)基：無機(jī)鹽母液 1 mL，蔗糖2 g，蒸餾水9 mL。

花期選取正常開花植株，將花序中上部小穗剪下(穎片已展開但花藥尚未開裂)。每個(gè)樣本收集30個(gè)花藥放在干凈玻璃片上，分別置于鋪有干燥濾紙和濕潤濾紙的培養(yǎng)皿，室溫(25℃)條件下保存?zhèn)溆谩４ㄋ幾匀婚_裂,花粉粒散出，每隔10 min用毛筆將花粉均勻散在置有培養(yǎng)基的凹面載玻片上，置于25℃暗培養(yǎng)30 min，在Olympus光學(xué)顯微鏡(100×)下觀察，每次選取5個(gè)視野(每個(gè)視野花粉粒數(shù)大于50)測定花粉活力，以花粉管長度超過花粉粒直徑2倍視為萌發(fā)，3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)其平均萌發(fā)率。花粉萌發(fā)率即代表其活力。持續(xù)測定直至萌發(fā)率值下降至零為止。

表1 試驗(yàn)材料的來源信息

1.2.2 柱頭可授性測定 采用Dafni的過氧化氫法[14]對芒雌蕊柱頭的可授性進(jìn)行測定：早上6∶00～8∶00，對當(dāng)天開花小穗進(jìn)行標(biāo)記，連續(xù)標(biāo)記10 d，取不同開花天數(shù)的雌蕊柱頭測定其可授性。將收集到的柱頭置于凹面載玻片中，滴加現(xiàn)配的3%過氧化氫溶液，5～10 min后在Olympus光學(xué)顯微鏡(40×)下觀察柱頭表面產(chǎn)生氣泡的情況。若柱頭表面有大量氣泡則判定為可授，柱頭表面僅有微量氣泡冒出或無氣泡則為不可授。根據(jù)氣泡數(shù)量將柱頭可授性強(qiáng)度分為4個(gè)等級。每40個(gè)柱頭為一組，統(tǒng)計(jì)具有可授性的柱頭數(shù)占供檢柱頭總數(shù)的比例，3次重復(fù)，取平均值。

1.2.3 花粉量/胚珠比(P/O)測定 在開花當(dāng)天，隨機(jī)選取即將開放、花藥尚未開裂的小穗，放入2 mL離心管中，每個(gè)離心管1個(gè)小穗(3個(gè)花藥)，室溫條件下靜置待花藥前端自然裂開散粉，加入1 mL碘液，在振蕩器下振蕩30s混勻后用移液槍吸取5 μL花粉溶液于載玻片上，在Olympus光學(xué)顯微鏡(40×)下直接觀察記數(shù)，測量的數(shù)值乘以200，即為一個(gè)小穗中的花粉粒總數(shù)，3次重復(fù)，最后計(jì)算平均值。芒的一個(gè)小穗中胚珠數(shù)為1，因此，其P/O值等于一個(gè)小穗中的花粉粒總數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)的平均值采用Microsoft Excel進(jìn)行，利用DPS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析，百分率數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析(Duncan法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力的測定

2.1.1 I2-KI染色法 I2-KI染色法判斷花粉是否具有生活力的主要依據(jù)是花粉內(nèi)含物淀粉遇碘發(fā)生變色反應(yīng)。芒花粉經(jīng)I2-KI染色后顏色較深，說明其花粉中的淀粉含量較高(圖1)。對10份不同基因型芒的花粉活力進(jìn)行測定，結(jié)果表明，不同基因型植株的花粉初始活力均較高，平均為78.68%±17.46%。

圖1 I2-KI染色法檢測芒基因型Mis06的花粉活力Fig.1 The pollen viability in M.sinensis genotype Mis06 determined with I2-KI staining method

測定芒小穗開花散粉后不同時(shí)間的花粉活力，發(fā)現(xiàn)散粉后不同時(shí)間段的花粉染色率較高，均達(dá)78%以上，差異不顯著(圖2)。實(shí)際而言，花粉在室溫下離體保存數(shù)小時(shí)后已經(jīng)完全失去活力，但由于花粉細(xì)胞內(nèi)的淀粉仍然存在，故仍被染色，采用I2-KI染色法對花粉活力跟蹤測定可能無法做出正確判斷。

圖2 I2-KI染色法測定的不同離體保存時(shí)間下芒基因型Mis06花粉活力Fig.2 The variation of pollen viability in M.sinensis at different in vitro storage duration determined by I2-KI staining method

2.1.2 離體萌發(fā)法 通過對Brewbaker & Kwack培養(yǎng)基中蔗糖的濃度進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)20%的蔗糖濃度對芒花粉的萌發(fā)及花粉管生長較為適宜。

在室溫(25℃)干燥和室溫濕潤兩種條件下，利用離體萌發(fā)法對不同基因型(n=10)的芒花粉活力進(jìn)行測定。結(jié)果表明，不同基因型的花粉活力存在明顯差異(圖3，表2)。不同保存條件下，花粉活力隨著離體時(shí)間的延遲不斷下降，最后完全失活，干燥條件下較濕潤條件下花粉活力的下降更快。花藥剛開裂時(shí)，花粉的平均萌發(fā)率為64.56%±15.86%，離體保存10 min后，濕潤條件下平均萌發(fā)率下降至57.67%±17.57%，而干燥條件下則降至44.38%±14.73%；濕潤條件下保存70 min后，平均萌發(fā)率為18.62%±7.90%，100 min后降低至0，而干燥保存條件下保存70 min后花粉活力完全喪失，萌發(fā)率為0(表2)。所以，室溫干燥條件下芒的花粉壽命約為70 min，濕潤條件下花粉壽命不超過100 min。

圖3 不同基因型芒花粉生活力的離體萌發(fā)檢測Fig.3 The determination of pollen viability in M.sinensis with in vitro germination method注：A.基因型Mis02 (58.22%);B.基因型Mis06(86.29%)

離體時(shí)間/min干燥最大值最小值平均值濕潤最大值最小值平均值090．0031．7164．56±15．8690．0031．7164．56±15．861078．6917．7444．38±14．7398．0825．6457．67±17．572072．458．3331．5±15．7983．0815．6650．05±15．293050．826．4119．89±13．1268．5721．6243．67±13．014055．062．1716．89±14．2068．7521．3338．94±12．155015．316．1011．47±3．3760．267．4732．16±13．346011．594．947．41±2．6956．529．7128．18±12．25700．000．000．0036．734．7218．62±7．90800．000．000．0030．435．1714．26±7．4890---18．751．6911．95±5．34100---0．000．000．00

對不同基因型花粉活力的檢測結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，不同基因型、不同保存時(shí)間及不同保存條件之間存在極顯著差異，表明它們對花粉活力均有極顯著影響(P<0.01)；基因型×保存時(shí)間×保存條件互作存在極顯著差異，表明不同基因型芒的花粉對不同保存時(shí)間和不同保存條件具有特殊的適應(yīng)性(表3)。

2.2 柱頭可授性

在自然條件下，芒雌蕊柱頭活力最高值出現(xiàn)在開花前一天(-1 DPA)和開花當(dāng)天(0 DPA)，柱頭可授性為100%；1 DPA時(shí)，柱頭可授性隨時(shí)間變化開始下緩慢下降，4 DPA時(shí)降低至50%；到7 DPA時(shí)只有極少數(shù)柱頭具可授性，8 DPA時(shí)完全喪失(表4)。由此可知，芒的柱頭可授期約為8 d，最佳可授期為-1～1 DPA。從柱頭可授性強(qiáng)弱分析，-1～1 DPA的柱頭呈現(xiàn)出強(qiáng)可授性，柱頭表面產(chǎn)生大量氣泡；從2～5 DPA柱頭呈現(xiàn)較強(qiáng)可授性，產(chǎn)生較多氣泡；到6 DPA，柱頭可授性逐漸減弱，產(chǎn)生少數(shù)氣泡(圖4)。

表3 芒花粉活力方差分析

注：****表示0.000 1極顯著水平

表4 開花后不同時(shí)間芒柱頭可授性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；-表示柱頭不具可授性；+表示柱頭具可授性；++表示柱頭具較強(qiáng)可授性；+++表示柱頭具強(qiáng)可授性

從柱頭顏色變化來看，最初穎片未展開時(shí)花蕾中的柱頭呈白色，此時(shí)的柱頭不具備可授性；而-1 DPA和0 DPA的柱頭顏色為鮮艷的紫紅色；2～7 DPA后柱頭顏色逐漸由紫紅色變?yōu)榘底霞t色，極少數(shù)柱頭呈現(xiàn)棕色甚至黑色。

圖4 基因型Mis06雌蕊柱頭在開花后不同天數(shù)的可授性強(qiáng)弱比較Fig.4 The comparison of stigma receptivity of genotype Mis06 at different days post-anthesis注：A.1 DPA時(shí)的柱頭可授性;B.6 DPA時(shí)的柱頭可授性

2.3 花粉量/胚珠比(P/O)

為了闡明芒屬于哪種類型的繁育系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)了其花粉量與胚珠比(P/O)，芒的每個(gè)小穗中包含3個(gè)花藥和一個(gè)胚珠，通過對其花粉量測定，發(fā)現(xiàn)不同基因型的單個(gè)小穗中平均花粉量存在較大的變異，但在花序同一位置上兩個(gè)孿生小穗的花粉量差異不大。每個(gè)小穗中的花粉量介于2 162±228～11 720±912，平均值為5 445±2 883。因?yàn)槊⒚總€(gè)小穗中的胚珠數(shù)目為1，因此芒的平均P/O值為5445±2883(圖5)。根據(jù)Cruden劃分的繁育系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)[15 ]，芒是屬于專性異交性植物。

圖5 不同基因型芒的平均P/O值Fig.5 The average P/O values of different M.sinensis genotypes

3 討論

研究采用I2-KI染色法和離體萌發(fā)法對芒的花粉活力進(jìn)行測定，其中I2-KI染色法的測定值與離體萌發(fā)法相比偏高，在煙草(Nicotianatabacum)等植物的花粉活力測定中也存在類似現(xiàn)象[16]。離體萌發(fā)法的測定值能更真實(shí)地反映花粉的活力變化規(guī)律，但其操作步驟耗時(shí)費(fèi)力，一般適用于花粉萌發(fā)需時(shí)較短的植物，如金魚草、煙草和百合等[13]；I2-KI染色法不能實(shí)時(shí)地反映花粉活力，但該方法操作步驟簡單，效率高，可用于花粉活力的初步篩查，特別是大樣本的花粉活力普查。

花粉量與胚珠比(P/O)是鑒定植物繁育系統(tǒng)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，芒的P/O平均值為5 445±2 883，屬于專性異交性植物，這與目前認(rèn)為芒為自交不親和性植物的觀點(diǎn)相一致。本研究表明，不同基因型芒植株花粉初始萌發(fā)活力及花粉壽命的差異明顯，室溫條件下的花粉平均萌發(fā)率為64.56%±15.86%，散粉后70～100 min內(nèi)其活力完全喪失，且干燥條件下活力下降比濕潤條件下更快，這是傳粉或授粉過程中的不利因素，極大地限制了傳粉距離和授粉時(shí)間。禾本科植物的花粉通常為三細(xì)胞花粉，壽命短，但有研究表明，較低溫度和較高濕度通常有利于花粉活力的保持，有利于植株的結(jié)實(shí)率[17]。李要民等[18]也發(fā)現(xiàn)低溫高濕(5℃、80%)條件下，水稻、玉米和狼尾草3種禾本科植物的花粉活力保持的時(shí)間可達(dá)30 d以上。芒的同一圓錐花序上小穗是從花序中部向上部和下部依次開放，整個(gè)花序開放時(shí)間持續(xù)數(shù)天，而雌蕊柱頭的可授性能持續(xù)8 d，可以有效緩解花粉壽命短對傳粉造成的壓力，因此，柱頭和花粉的活性不是限制芒植株自交結(jié)實(shí)的因子。

蕾期人工授粉通常是克服植物自交不親和性的一種有效途徑與方法[19-20]。研究表明，芒雌蕊柱頭在開花前一天(-1 DPA)已具備了較高的可授性，這為采用蕾期人工授粉方法以獲得其自交種子及培育純系提供了可能。純系的培育可以為進(jìn)一步開展芒的遺傳學(xué)分析、雜種優(yōu)勢利用以及全基因組測序等研究奠定材料基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

芒屬于專性異交性植物，在開花期內(nèi)其花粉和雌蕊柱頭的活性均能維持較高水平，而且兩者的成熟期可以相遇，說明它們并不是導(dǎo)致芒發(fā)生自交不親和性的原因。此外，利用芒繁育系統(tǒng)的特點(diǎn)開展不同基因型之間的人工雜交育種是十分可行的。

[1] 劉亮,朱明,朱太平.芒荻類植物資源的開發(fā)和利用 [J].自然資源學(xué)報(bào),2001,16(6):562-563.

[2] Zub H W,Brancourt-Hulmel M.Agronomic and physiological performances of different species of Miscanthus,a major energy crop.A review[J].Agronomy for Sustainable Development,2010,30(2):201-214.

[3] Chung J,Kim D.Miscanthus as a potential bioenergy crop in East Asia[J].Journal of Crop Science and Biotechnology,2012,15(2):65-77.

[4] 文浩,艾辛,蔣建雄,等.采用SSR分子標(biāo)記鑒定荻與南荻F1雜交種的真實(shí)性[J].草原與草坪,2013,33(4):7-11,22.

[5] 梁緒振,陳太祥,白史且,等.芒屬(Miscanthus)植物種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].草業(yè)與畜牧,2010(10):1-5.

[6] 陳少風(fēng)，何俊，周樸華，等.芒和五節(jié)芒的核型研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008(1)：123-126.

[7] 于慧，胡曉穎，徐信蘭，等.須芒草族植物花粉形態(tài)的觀察[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2000(2)：164-170.

[8] Collura S,Azanbre B,Finqueneisel G,etal.Miscanthus x giganteus straw and pellets as sustainable fuels:combination and emission tests[J].Environmental Chemistry Letters,2006,4(2):75-78.

[9] Heaton E A,Dohleman F G,Long S P.Meeting U.S.biofuel goals with less land:The potential of Miscanthus[J].Global Change Biology,2008,14(9):2000-2014.

[10] 傅鮮桃,楊春華,陳靈鷙,等.“廣益”扁穗牛鞭草花粉特性及結(jié)實(shí)性研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2008,17(2):61-76.

[11] 趙金花,李青豐,那仁圖雅,等.3種野生蔥屬植物花粉活力和柱頭可授性研究[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(4):93-96.

[12] 于曉英,盧向陽,龔明福,等.瓜葉菊花粉生活力研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版),2005,31(1):42-46.

[13] 胡適宜.植物胚胎學(xué)試驗(yàn)方法(一):花粉生活力的測定[J].植物學(xué)通報(bào),1993,10(2):60-62.

[14] Dafni A,Kevan P G,Husband B C.Practical pollination biology[M].Cambridge,Ontarie,Canada:Enviroquest Ltd,2005：47-51.

[15] Cruden R W.Pollen-ovule ratios:a conservative indicator of breeding systems in flowering plants[J].Evolution,1977,31(1):32-46.

[16] 孫光玲,汪銀生,胡乾政.煙草花粉貯藏與活力測定[J].中國煙草,1994(1):20-22.

[17] 李訓(xùn)貞,梁滿中,周廣洽,等.水稻開花時(shí)的環(huán)境條件對花粉活力和結(jié)實(shí)的影響[J].作物學(xué)報(bào),2002,28(3):417-420.

[18] 李要民,陳良碧.不同溫濕條件下貯藏的3種禾本科植物花粉活力變化[J].植物生理學(xué)通訊,1998,34(1):35-37.

[19] Rêgo M M,Rêgo E R,Bruckner C H,etal.Overcoming self-incompatibility in passion fruit by double pollination in anthesis stages[J].Acta Horticulturae,2013,1000:533-536.

[20] Gradziel T M,Robinson R W.Breakdown of self-incompatibility during pistil development in Lycopersicon peruvianum by modified bud pollination[J].Sexual Plant Reproduction,1989,2(1):38-42.

Study on pollen viability and stigma receptivity ofMiscanthussinensis

SUN Kou-zhong1,HU Bin2,JIANG Jian-xiong2,3

(1.XinyangAgriculturalExperimentStationofYanchengCity,Yancheng224049,China; 2.CollegeofBioscience&Biotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 3.BiofuelsInstitute,CollegeofEnvironmentandSafetyEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

The pollen viability for differentMiscanthussinensisgenotypes and the pollen life-span under dry or wet storage conditions were evaluated by in vitro pollen germination method and I2-KI staining method,and the stigma receptivity was also determined with H2O2method.Results showed that the anther ofM.sinensishad a large number of pollen grains with a mean pollen-ovule ratio (P/O) up to 5445±2883,belonging to a reproduction system of oligate xenogamy.The average initial pollen viability was 78.68%±17.46%,but at room temperature (25℃),the pollen viability for all tested genotypes only lasted around 70 minutes under dry storage condition and 110 minutes under wet condition,respectively.The different genotypes kept a higher stigma receptivity until 8 days post-anthesis (8 DPA),and the optimal period to receive pollen grains was from -1 DPA to 1 DPA.

Miscanthussinensis;pollen viability;stigma receptivity;P/O

2016-07-05；

2016-10-31

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目 (CX(15)1005) 和國家863課題(2012AA10180104)資助

孫扣忠(1965-)，女，江蘇阜寧人，助理研究員，研究方向?yàn)橹参镞z傳育種研究。 E-mail：sunkouzhong@126.com 蔣建雄為通訊作者。

Q 944.58

A

1009-5500(2017)01-0014-06