大氣CO2濃度升高對轉基因玉米Bt毒素表達量的影響

劉凱強, 解海翠, 張天濤, 白樹雄, 王振營, 何康來*

(1.中國農業科學院植物保護研究所, 北京 100193; 2. 河北科技師范學院生命科技學院, 秦皇島 066000)

大氣CO2濃度升高對轉基因玉米Bt毒素表達量的影響

劉凱強1, 解海翠2, 張天濤1, 白樹雄1, 王振營1, 何康來1*

(1.中國農業科學院植物保護研究所, 北京 100193; 2. 河北科技師范學院生命科技學院, 秦皇島 066000)

大氣CO2濃度升高不僅影響植物營養化學成分的變化, 還能夠引起植物次生抗蟲物質表達量的改變, 進而影響作物-害蟲的互作關系。本試驗利用開頂式氣室(OTC)和室內動態氣室模擬當前和未來大氣CO2濃度(約390、550、750 μL/L)環境, 測定了不同大氣CO2濃度下普通玉米‘鄭58’和轉cry1Ac-m基因玉米的營養物質成分、轉cry1Ac-m基因玉米Cry1Ac殺蟲蛋白的含量, 以及取食不同大氣CO2濃度環境下生長的‘鄭58’或轉cry1Ac-m基因玉米葉片的亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)初孵幼蟲死亡率。結果表明, 與對照相比, 高大氣CO2濃度(750 μL/L)環境下生長的轉基因和對照玉米葉片中淀粉、可溶性糖、非結構性碳(TNC)含量及TNC∶N都明顯增加, 而N含量差異不顯著。對照玉米葉片的N含量顯著高于轉基因玉米, 其他營養成分沒有顯著變化。隨著大氣CO2濃度的升高, 轉基因玉米的Cry1Ac蛋白表達量有下降的趨勢, 但各處理間差異不顯著。亞洲玉米螟取食生長在不同大氣CO2濃度環境下的‘鄭58’或轉cry1Ac-m基因玉米葉片48 h后,死亡率沒有顯著差異;轉cry1Ac-m基因玉米具有顯著的殺蟲效果。

大氣CO2; 轉基因玉米; 亞洲玉米螟; Bt毒素

大氣CO2濃度上升可提高植物的光合能力和生產力, 影響植物組織內化學物質累積。一方面, 大氣CO2濃度升高影響植物營養化學物成分的變化,多數研究報道認為大氣CO2濃度升高使植物組織內C/N增加, 即組織內碳水化合物含量提高, 含N化合物含量降低[1-5];另一方面, 大氣CO2濃度升高也會引起植物次生抗蟲物質的表達發生變化, 如大氣CO2濃度升高會促進針葉林總酚和單萜的積累[6]。紫苜蓿Medicagosativa(L.)組織中皂苷含量隨著大氣CO2濃度升高而顯著提高, 但組織中黃酮類化合物含量變化不大[7]。大氣CO2濃度升高環境下生長的轉基因棉花棉鈴內Bt蛋白表達量顯著降低[8]。

玉米是重要的糧食、飼料及工業原料, 亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)是嚴重為害玉米的重要害蟲。轉基因抗蟲玉米的出現, 為防治玉米害蟲提供了新的途徑, Bt蛋白作為轉基因玉米表達的最重要的外源性抗蟲物質, 在大氣CO2濃度升高情況下的表達量變化是一個值得研究的問題。目前, 關于大氣CO2濃度升高下, 轉基因玉米Bt蛋白表達量變化的研究尚未見報道。

本試驗測定了不同大氣CO2濃度下普通玉米‘鄭58’和轉cry1Ac-m基因玉米的營養物質含量、轉cry1Ac-m基因玉米Cry1Ac殺蟲蛋白表達量, 并測定了取食兩種玉米離體組織的亞洲玉米螟初孵幼蟲的死亡率, 為未來氣候變化情境下轉基因玉米抗蟲性的變化趨勢與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 不同大氣CO2環境

試驗于2015年在15個正八邊形開頂式氣室(open-top chamber, OTC)內進行(直徑4.2 m, 高3.8 m), 氣室位于吉林省公主嶺市中國農業科學院植物保護研究所野外科學觀測試驗站。試驗設置3個大氣CO2濃度處理, 即約390 μL/L(當前大氣CO2濃度)、 550 μL/L和750 μL/L(通過預測得到的未來大氣CO2濃度)[9-10]。OTC由氣室、控制室及控制系統組成, 具體結構和調控方式詳見文獻[11]。OTC內試驗設計采用裂區設計, 大氣CO2濃度為主區, 玉米品種為裂區, 即先按照大氣CO2濃度設置3個處理的小區(主處理);然后在主處理的小區內引進玉米品種的2個處理(副處理),共有6個處理, 重復5次。

1.2 供試玉米

試驗所用玉米品種包括轉cry1Ac-m基因玉米(啟動子:花椰菜花葉病毒啟動子CaMV35S,終止子:胭脂堿合成酶基因(nos)終止子), 對照‘鄭58’(轉基因玉米受體), 均由中國農業大學玉米中心提供。于5月10日播種, 行距50 cm, 株距30 cm, 每氣室中間以60目紗網分開, 左右兩側分別種植30株轉基因玉米和對照玉米。

1.3 供試亞洲玉米螟

亞洲玉米螟O.furnacalis來自吉林省公主嶺市田間自然發生種群, 在室內用人工飼料[12]飼養數代后備用。

1.4 玉米組織內化學物質含量測定

玉米播種45 d后, 每小區隨機取5株玉米, 取其葉片剪碎混勻后測定碳水化合物和Cry1Ac蛋白等化學物質含量。非結構性碳(淀粉和糖類)采用Tissue和Wright[13]的方法測定。用凱氏定氮法(Model KDY-9830 凱氏定氮儀,北京)測定氮含量。采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定Cry1Ac蛋白含量, 試劑盒為Agdia公司生產(試劑盒貨號:PSP06200,檢測靈敏度:0.01 ppb)。

1.5 玉米葉片室內生測

分別采集3個大氣CO2濃度OTC中的玉米葉片, 放在直徑9 cm的塑料培養皿中(皿蓋上有直徑3.5 cm圓孔, 覆以100目尼龍紗網, 保證培養皿內的CO2濃度), 接入亞洲玉米螟初孵幼蟲50頭。每處理分兩組, 分別放在CO2濃度與葉片生長環境相同的人工氣候箱(CDCC-1型, 寧波賽福PRX-450D-CO2)和當前大氣CO2濃度人工氣候箱(CDCC-1型, 寧波賽福PRX-450D)內飼養。人工氣候培養箱內溫度為白天(28±1)℃, 夜間(27±1)℃;相對濕度75%～85%;光周期L∥D=16 h∥8 h。

1.6 數據統計分析

對玉米品質的影響和對玉米螟死亡率的影響采用裂區設計的方差分析, 對Bt毒素表達量采用單因素方差分析, 平均數比較采用LSD檢驗,P<0.05。統計分析計算用SAS軟件實現。

2 結果與分析

2.1 玉米葉片化學成分含量

不同大氣CO2濃度環境下生長的玉米, 其葉片的可溶性糖和淀粉含量差異顯著, 而N含量差異不顯著(表1), 因而非結構性碳比氮(TNC∶N)差異顯著。與當前大氣CO2濃度相比, 在750 μL/L CO2濃度環境下生長的玉米葉片可溶性糖、淀粉、TNC含量和TNC∶N分別增加了15.9%、10.3%、12.0%和17.3%, N含量沒有顯著差異;而在550 μL/L CO2濃度環境下生長的玉米葉片除TNC∶N顯著升高了7.0%外, 其余參數無顯著差異(圖1)。與550 μL/L CO2濃度相比, 750 μL/L CO2濃度下生長的玉米葉片可溶性糖含量、TNC含量和TNC∶N顯著升高了16.4%、9.0%、9.5%, 淀粉含量沒有顯著差異。

‘鄭58’玉米葉片的N含量極顯著地高于轉基因玉米, 對照玉米和轉基因玉米的可溶性糖、淀粉、TNC含量和TNC∶N沒有顯著差異(表1, 圖1)。品種和CO2的交互作用對玉米葉片的可溶性糖、淀粉、TNC、氮含量、TNC∶N都沒有顯著影響(表1)。

圖1 不同CO2濃度下玉米葉片中幾種化學物質含量及不同玉米品種葉片的氮含量Fig.1 Contents of several compounds in the leaves of maize under different CO2 levels and N content in the leaves of different varieties of maize

化合物Compound二氧化碳CO2品種Variety二氧化碳×品種CO2×Variety可溶性糖SolublesugarF5.254.521.83df2,271,282,24P0.0350.0550.202淀粉StarchF5.660.730.64df2,271,282,24P0.0290.4100.542非結構性碳TNCF8.874.192.32df2,271,282,24P0.0090.0630.141氮NF3.1526.920.86df2,271,282,24P0.098<0.0010.448非結構性碳∶氮TNC∶NF19.350.341.62df2,271,282,24P<0.0010.5730.239

2.2 Cry1Ac蛋白表達量

由表2可知,隨著大氣CO2濃度的升高,轉基因玉米組織中Cry1Ac蛋白表達量有下降的趨勢, 但不同濃度間沒有顯著差異。

表2 不同CO2濃度下生長的轉cry1Ac-m基因玉米葉片的Cry1Ac蛋白表達量

Table 2 Cry1Ac protein contents in the leaves of GM maize under different CO2levels

CO2濃度/μL·L-1CO2levelCry1Ac蛋白表達量/mg·g-1QuantityofCry1AcproteinMean±SEFdfP約3901.91±0.090.362,120.70625501.88±0.067501.82±0.08

2.3 不同處理下亞洲玉米螟48 h的死亡率

組織離體生測結果顯示, 不同玉米品種的殺蟲效果差異顯著(表3)。與‘鄭58’玉米相比, 轉cry1Ac-m基因玉米有顯著的殺蟲效果, 亞洲玉米螟初孵幼蟲取食48 h后, 死亡率都達到了95.8%以上, 而取食‘鄭58’玉米的死亡率小于7.4%(表4)。不同大氣CO2濃度處理的亞洲玉米螟幼蟲存活率間差異不顯著, 且大氣CO2濃度與品種間交互作用不顯著(表3)。

表3 不同處理間差異顯著性方差分析統計參數

Table 3 Statistic parameters of analysis of variance among the treatments

變異來源Sourceofvariance統計參數StatisticparameterdfFP玉米品種Cornvariety982343.16<0.0001大氣CO2濃度AtmosphericCO2971.010.4172玉米品種×大氣CO2濃度Cornvariety×atmosphericCO2950.320.8629

表4 不同處理間亞洲玉米螟48 h的死亡率

Table 4 Mortality ofOstriniafurnacaliswithin 48 h among different treatments

玉米品種Cornvariety生長環境大氣CO2濃度/μL·L-1AtmosphericCO2levelofambientenvironment生測環境大氣CO2濃度/μL·L-1AtmosphericCO2levelofbioassayenvironment死亡率/%Mortalityrate鄭58 Zheng58約390約3905.4±1.49鄭58 Zheng58550約3907.4±2.11鄭58 Zheng58750約3905.6±2.17鄭58 Zheng585505505.6±1.71鄭58 Zheng587507505.0±2.20轉cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene約390約39095.8±1.41轉cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene550約39099.4±0.31轉cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene750約39097.2±0.80轉cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene55055097.4±0.67轉cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene75075096.8±1.04

3 討論

大氣CO2濃度升高,使植物光合作用底物濃度增加,光合作用效率增加,提高植物生產力,相當于“施肥效應”[14-15],同時引起植物組織內不同化合物成分與含量發生變化[16-18]。然而,不同作物對“施肥效應”的反應水平或效果差異較大。關于大氣CO2濃度升高對植物營養成分含量影響的研究很多,但大多數集中在對C3植物的研究上,對C4植物的研究相對較少。本試驗研究顯示,大氣CO2濃度升高,玉米葉片中淀粉和可溶性糖含量、TNC∶N都明顯增加,這與前人的研究結果相同[5,8,19]。一般來講,大多數植物(尤其是C3植物)的光合作用速率和生長會隨著CO2濃度的升高而提高[20-21],進而會提高葉片對C/N和水利用效率,葉片N含量降低[22-23]。另一些研究則認為,大氣CO2濃度升高對不同作物的影響不同。如生長在高CO2濃度環境下的紅車軸草Trifoliumpratense(L.)和草木樨Melilotusalba(Desr.)(C3植物,豆科)的C、N含量以及C/N沒有差異[24]。即使是同一作物,不同研究者所用品種與栽培方式不同、測定的組織不同,其結果也存在差異。如,大氣高CO2濃度環境下,盆栽的‘Kedan 8’玉米籽粒中蛋白、TNC/蛋白顯著增加,但TNC的含量差異不顯著[25],而在直播的‘XY335’玉米葉和莖中TNC含量比對照均顯著增加[11]。土壤的施N量也會影響植物組織的C/N[26-27]。在本試驗中,不同大氣CO2環境下生長的玉米葉片的N含量差異不顯著。這可能與品種有關,本研究所用玉米品種為自交系‘鄭58’及其轉cry1Ac-m基因品系。但本研究中TNC/N 的結果與已報道的玉米相關研究結果一致。

與對照玉米相比,轉基因玉米葉片N含量顯著降低,其他營養成分差異不顯著,這可能與外源基因的插入有關。Chen等[8]的研究也發現生長在CO2濃度為750 μL/L的開頂式氣室環境中的轉基因棉花的N含量顯著低于非轉基因棉花。

Bt蛋白屬于轉基因玉米植株內的氮源抗蟲物質,轉cry1Ac-m基因玉米葉片中Cry1Ac殺蟲蛋白表達量沒有隨著大氣CO2濃度的升高而改變,這與本試驗中玉米葉片N元素含量沒有顯著變化保持一致。有報道表明,轉Bt基因抗蟲棉棉鈴內Bt殺蟲蛋白表達量受大氣CO2濃度升高影響而顯著降低,降低幅度與棉花中N含量有關[8,25,28],而Coviella等[29]報道,大氣CO2濃度升高的情況下,改變土壤施N量,葉片的含N量和Bt蛋白的表達量變化是一致的,即隨著施N量的增加,使得葉片N含量和Bt蛋白表達量下降的趨勢變得不顯著。白樹雄[30]研究認為外源基因的導入并沒有對轉基因玉米抗蟲次生物質產生影響,這與本試驗結果一致。外源基因的導入是否會引起轉基因作物體內次生代謝物質表達量的變化是有爭議的，如有研究表明轉基因棉植株體內的單寧酸、棉酚表達量與對照親本表達量不同[31]。因此,轉Bt基因抗蟲作物外源殺蟲Bt蛋白的表達量是否受大氣CO2濃度升高的影響因作物品種、土壤中氮肥含量、外源基因導入方式等而異。

對玉米組織的離體生測結果顯示,轉cry1Ac-m基因玉米品種相比‘鄭58’的殺蟲效果顯著,這與試驗中大氣CO2濃度升高對轉基因抗蟲玉米Bt蛋白表達量沒有顯著影響一致。本試驗只進行了離體玉米組織的抗蟲性研究,而在大氣CO2濃度升高情況下,田間不同品種玉米的抗蟲性鑒定需要進一步的研究。

[1] Bezemer T M, Jones T H. Plant-insect herbivore interactions in elevated atmospheric CO2: quantitative analyses and guild effects [J]. Oikos, 1998, 82(2): 212-222.

[2] Veteli T O, Kuokkanen K, Julkunen-Tiitto R, et al.Effects of elevated CO2and temperature on plant growth and herbivore defensive of chemistry[J]. Global Change Biology, 2002, 8(12): 1240-1252.

[3] Stacey D A, Fellowes M D E. Influence of elevated CO2on interspecific interactions at higher trophic levels[J]. Global Change Biology, 2002, 8(7): 668-678.

[4] Hamilton J G, Dermody O, Aldea M, et al.Anthropogenic changes in tropospheric composition increase susceptibility of soybean to insect herbivory[J]. Environmental Entomology, 2005, 34(2): 479-485.

[5] Xie Haicui, Liu Kaiqiang, Sun Dandan, et al. A field experiment with elevated atmospheric CO2-mediated changes to C4crop-herbivore interactions [J]. Scientific Reports, 2015: 13923.

[6] Idso C D, Idso K E. Forecasting world food supplies: The impact of rising atmospheric CO2concentration [J]. Technology, 2000, 7: 33-55.

[7] Agrell J, Anderson P, Oleszek W, et al. Combined effects of elevated CO2and herbivore damage on alfalfa and cotton [J]. Journal of Chemical Ecology, 2004, 30(11): 2309-2324.

[8] Chen Fajun, Wu Gang, Ge Feng, et al. Effects of elevated CO2and transgenic Bt cotton on plant chemistry, performance, and feeding of an insect herbivore, the cotton bollworm [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 2005, 115(2): 341-350.

[9] Watson R T, Zinyowera M C, Moss R H. Climate change 1995: impacts, adaptations and mitigation of climate change: scientific-technical analysis [M]. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1996.

[10]Houghton J T, Ding Y, Griggs D J, et al. Climate change 2001: the scientific basis [M]. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2001.

[11]解海翠. 大氣 CO2濃度升高對 “玉米—害蟲—天敵” 系統的影響[D]. 北京: 中國農業大學, 2014.

[12]周大榮, 何康來. 玉米螟綜合防治技術[M]. 北京: 金盾出版社, 1995.

[13]Tissue D T, Wright S J. Effects of seasonal water availability on phenology and the annual shoot carbohydrate cycle of tropical forest shrubs [J]. Functional Ecology, 1995, 9: 518-527.

[14]Gunderson C A, Norby R J, Wullschleger S D. Foliar gas exchange of two deciduous hardwoods during 3 years of growth in elevated CO2: no less of photosynthetic enhancement[J]. Plant, Cell & Environment, 1993, 16: 979-807.

[15]Rogers H H, Runion G B, Krupa S V. Plant responses to atmospheric CO2enrichment with emphasis on roots and the rhizosphere [J]. Environment Pollution, 1994, 83: 155-189.

[16]Slansky F, Feeny P.Stabilization of the rate of nitrogen accumulation by larvae of the cabbage butterfly on wild and cultivated food plants [J]. Ecological Monographs, 1997, 47(2): 209-228.

[17]Mattson W J. Herbivory in relation to plant nitrogen contents[J]. Annual Review of Ecology and Systematics, 1980, 11: 119-161.

[18]White T C R. The abundance of invertebrate herbivores in relation to the availability of nitrogen in stressed food plants [J]. Oecologia, 1984, 63(1): 90-105.

[19]Williams R S, Lincoln D E, Norby R J. Leaf age effects of elevated CO2-grown white oak leaves on spring-feeding lepidopterans [J]. Global Change Biology, 1998, 4(3): 235-246.

[20]Wong S C.Elevated atmospheric partial pressure of CO2and plant growth I. Interactions of nitrogen nutrition and photosynthetic capacity of C3 and C4 plants [J]. Oecologia, 1979, 44(1): 68-74.

[21]Rodgers H H, Thomas J F, Bingham G E. Responses of agronomic and forest species to elevated atmospheric carbon dioxide[J]. Science, 1983, 220: 428-429.

[22]Kimball B A, Lamorte R L, Seay R S, et al. Effects of free-air CO2-enrichment on energy balance and evapotranspiration of cotton [J]. Agricultural and Forest Meteorology, 1994, 70: 259-278.

[23]Lindroth R L, Arteel G E, Kinney K K. Responses of three saturniid species to paper birch grown under enriched CO2atmospheres [J]. Functional Ecology, 1995, 9(2): 306-311.

[24]Karowe D N. Are legume-feeding herbivores buffered against direct effects of elevated carbon dioxide on host plants? A test with the sulfur butterfly,Coliasphilodice[J]. Global Change Biology, 2007, 13(10): 2045-2051.

[25]Yin Jin, Sun Yucheng, Wu Gang, et al. Effects of elevated CO2associated with maize on multiple generations of the cotton bollworm,Helicoverpaarmigera[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 2010, 136(1): 12-20.

[26]Ainsworth E A, Long S P.What have we learned from 15 years of free‐air CO2enrichment (FACE)? A meta‐analytic review of the responses of photosynthesis, canopy properties and plant production to rising CO2[J]. New Phytologist, 2005, 165(2): 351-372.

[27]馬紅亮, 朱建國, 謝祖彬, 等. 開放式空氣CO2濃度升高對冬小麥生長和N吸收的影響[J]. 作物學報, 2005, 31(12): 1634-1639.

[28]Coviella C E, Morgan D J W, Trumble J T. Interactions of elevated CO2and nitrogen fertilization: Effects on production ofBacillusthuringiensistoxins in transgenic plants [J]. Environmental Entomology, 2000, 29(4): 781-787.

[29]Coviella C E, Stipanovic R D, Trumble J T. Plant allocation to defensive compounds: interactions between elevated CO2and nitrogen in transgenic cotton plants [J]. Journal of Experimental Botany, 2002, 53(367): 323-331.

[30]白樹雄. 轉基因抗蟲玉米次生代謝物質的變化及對亞洲玉米螟寄生性天敵腰帶長體繭蜂的影響[D].北京: 中國農業科學院, 2011.

[31]陸宴輝, 劉芳, 楊益眾, 等. 轉基因棉棉株體內主要營養物質和次生物質含量分析[J]. 江蘇農業學報, 2005, 21(2): 92-97.

(責任編輯：田 喆)

Effects of elevated atmospheric CO2concentration on the expression of Bt toxin in transgenic maize

Liu Kaiqiang1, Xie Haicui2, Zhang Tiantao1, Bai Shuxiong1, Wang Zhenying1, He Kanglai1

(1.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,Qinhuangdao066000,China)

Elevated CO2(eCO2) will generally lead to the change of chemical composition of plants. On the other hand,eCO2may also mediate the changes in plant secondary metabolism, which will affect the plant-herbivore interaction. This research simulated the growth and development of the corn line ‘Zheng 58’ and a line expressing Bt Cry1Ac toxin (GM-line),Ostriniafurnacalisand their interactions under ambient environment with twoeCO2(about 390 μL/L, 550 μL/L, 750 μL/L) with open top chambers (OTCs) and closed dynamic chambers (CDC). Corn plant chemistry, especially the C and/or N contents as well as Cry1Ac toxin were assessed. The results showed that the starch and soluble sugar content, TNC and TNC∶N were significantly increased in the plant tissues undereCO2(750 μL/L) OTC, but the N contents in leaves were not significantly different among CO2concentrations. However, the N content in leaves of ‘Zheng 58’ was significantly higher than that in GM-line. Although the amount of Cry1Ac toxin expressed in GM-line leaves declined along with the increase in atmospheric CO2level, there was no significant difference among atmospheric CO2treatments.eCO2did not significantly affect the mortality ofO.furnacalisin 48 h. The survival rate was significantly lower in GM-line.

atmospheric carbon dioxide; transgenic maize;Ostriniafurnacalis; Bt toxin

2016-05-03

2016-07-10

公益性行業(農業)科研專項(201303026)

S 435.132

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.010

* 通信作者 E-mail: klhe@ippcaas.cn