羊口瘡自然病例的分子學(xué)診斷及病理形態(tài)學(xué)觀察

武 鑫， 胡 玥， 李良娟， 何潔玉， 王嘉晨， 彭遠(yuǎn)義， 吳建云， 胡 艷,2

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 重慶北碚400715 ； 2.重慶市茂澤科技有限公司 ， 重慶江北401120)

羊口瘡自然病例的分子學(xué)診斷及病理形態(tài)學(xué)觀察

武 鑫1， 胡 玥1， 李良娟1， 何潔玉1， 王嘉晨1， 彭遠(yuǎn)義1， 吳建云1， 胡 艷1,2

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 重慶北碚400715 ； 2.重慶市茂澤科技有限公司 ， 重慶江北401120)

重慶市某羊場發(fā)生了急性熱性傳染病,通過對發(fā)病羊只進(jìn)行采樣并對其進(jìn)行分子生物學(xué)診斷，病理組織H.E.染色觀察；通過PCR擴(kuò)增檢測出羊痘特異基因P32為陰性，羊口瘡特異性基因B2L為陽性，經(jīng)測序基因比對確診為羊口瘡；病變組織觀察發(fā)現(xiàn)在肝、肺、舌組織中炎性細(xì)胞浸潤，并在組織間隙中發(fā)現(xiàn)大量嗜酸性病毒顆粒，肝臟、舌組織部分細(xì)胞破裂，肺臟出現(xiàn)增生現(xiàn)象。

羊痘 ； 羊口瘡 ； PCR診斷 ； 組織學(xué)觀察

羊口瘡，由羊口瘡病毒(ORFV)引起，該病毒為痘病毒科、副痘病毒屬的成員。該病為急熱性傳染病，臨床特征一般在少毛無毛處長出痘疹，如嘴唇周圍、舌、鼻、臉頰、外陰唇、尾腹側(cè)等處，毛濃密處亦有可能出現(xiàn)痘痂，痘疹根據(jù)發(fā)病病理過程先后出現(xiàn)斑疹、丘疹、水皰、膿皰、潰瘍、結(jié)痂。其臨床癥狀易與羊痘病毒混淆，容易導(dǎo)致誤診。

1 材料與方法

2014年11月，重慶市江北區(qū)綦江某羊場有104只波爾山羊，其中30只出現(xiàn)急熱性傳染病，死亡8只?；疾⊙虺霈F(xiàn)高熱、食欲不振、眼瞼水腫或失明、跛行，在臉頰及尾根處有痘痂的癥狀，有些羊繼發(fā)感染肺炎、腸炎。根據(jù)臨床癥狀進(jìn)行采樣，用無菌PBS(pH值=7.2)采集痘疹組織，并對出現(xiàn)漿液滲出性肺炎及腸炎死亡羊只的舌、肝、肺、腸組織采樣，將病料組織切成1.5 cm3置于10%中性福爾馬林溶液中固定保存。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

痘痂處理:取患病羊的痘疹結(jié)痂，加入無菌PBS(pH值=7.2)和適量滅菌石英砂研磨制成1∶5懸液，反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min離心30 min，取上清。采用蛋白酶K及TRIZol聯(lián)合處理提取病毒DNA基因組，用10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K(58 ℃孵育 20 min、65 ℃消化30 min)消化后再經(jīng)300 μL TRIZol(需加入β巰基乙醇) /700 μL上清液5 min處理，離心柱提取病毒全基因組。并將基因組于-20 ℃保存，后續(xù)進(jìn)行PCR鑒別[1-3]。

病變組織H.E.染色：對已固定的組織通過自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，蘇木素、伊紅染色，再次脫水，透明，膠封片等過程分別制作舌、肝臟、肺臟病理組織切片。經(jīng)OLYPMUS光學(xué)顯微鏡觀察拍照，比對分析。

PCR擴(kuò)增：根據(jù)臨床癥狀，進(jìn)行山羊痘病毒與羊口瘡病毒鑒別，分別根據(jù)參照羊痘病毒與羊口瘡病毒全基因組及參考文獻(xiàn)[4-6]對羊痘P32基因與羊口瘡病毒B2L基因各設(shè)計(jì)合成兩對引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司制作，引物序列見表1。

表1 引物序列

以病料處理后提取的病毒基因組為模板，上述反應(yīng)體系為25 μL體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1 μL,模板2 μL。

擴(kuò)增條件：96 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性 1 min，57.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳及成像：取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL的6×Loading Buffer，DL-2 000 DNA Marker經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用BIO-RAD成像系統(tǒng)拍照觀察。

PCR擴(kuò)增序列分析:將PCR陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。將得到的測序結(jié)果命名為Chongqing 2014并在GenBank上比對分析，根據(jù)地理位置篩取33株系B2L基因通過MEGA5.05軟件進(jìn)行序列比對分析，通過ClustalW進(jìn)行多序列比對，通過最優(yōu)模式篩選，選擇Tamura 3-parameter(+G)模式，選用最大可能性法(Maximum Likelihood methods)，通過Bootstrap重復(fù)次數(shù)1 000進(jìn)行測試后建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。篩選后的33株B2L基因相關(guān)信息見表2。

表2 親緣關(guān)系比對33株B2L基因詳細(xì)信息

3 結(jié)果

3.1 PCR電泳鑒定結(jié)果 見圖1、2。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DL-2 000 Marker; 1、2泳道：P32 pair 1； 3、4泳道：P32 pair 2；5、6泳道：B2L pair 1； 7、8泳道：B2L pair 2

3.2 測序序列結(jié)果 見圖2。

3.3 B2L基因同源性分析結(jié)果 見圖3。

圖3 B2L基因系統(tǒng)進(jìn)化樹, 通過MEGA 5.05 進(jìn)行親緣關(guān)系分析，分為兩種類型；Ⅰ型B2L基因；Ⅱ型B2L基因

3.4 病理組織學(xué)觀察結(jié)果 舌組織整體形態(tài)較完整，在黏膜層與固有層交界、舌乳頭間質(zhì)、骨骼肌纖維、可見大量嗜酸性顆粒并伴有大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞浸潤，偶見少量嗜酸性粒細(xì)胞(見圖4)，舌乳頭表面的復(fù)層扁平細(xì)胞壞死破裂，有些舌乳頭分泌出未染色的結(jié)晶被排出體外(見圖5)，部分骨骼肌纖維斷裂溶解，骨骼肌周邊可見大量嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(見圖6)，組織中微動脈有嗜酸性顆粒組成的血栓形成，血管周邊嗜堿性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等浸潤包圍(見圖7)，組織嗜酸性顆粒粒徑在 2-3 μm 之間。

圖4 病變舌黏膜層固有層可見大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞浸潤 注：箭頭示嗜酸性顆粒，比例尺50 μm

圖5 舌乳頭復(fù)層扁平上皮細(xì)胞崩解 注：箭頭示嗜酸性顆粒，三角示分泌結(jié)晶，比例尺50 μm

圖6 舌骨骼肌崩解 注：箭頭示嗜酸性顆粒，三角示嗜堿性粒細(xì)胞吞噬嗜酸性顆粒，比例尺50 μm

圖7 舌微動脈中的血栓，動脈周邊各類炎性細(xì)胞浸潤 注：箭頭示嗜酸性顆粒，比例尺50 μm

肝臟完整形態(tài)被破壞，肝小葉間交界變模糊，肝板間肝血竇溶解消失，小葉間膽管壁變薄，部分肝細(xì)胞空泡變形或破裂凋亡，可見大量嗜酸性顆粒從凋亡細(xì)胞釋出，肝索間可見大量嗜酸性病毒顆粒，肝小葉可見巨噬細(xì)胞，部分嗜酸性顆粒被巨噬細(xì)胞吞噬(見圖8)[11]。

由于繼發(fā)感染，發(fā)生漿液性滲出性肺炎，支氣管上皮組織消失被瘢痕組織替代，原杯狀細(xì)胞位置為成纖維細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等替代，支氣管可見漿細(xì)胞滲出(見圖9)，肺泡壁上皮細(xì)胞可見增生，由扁平上皮化生為立方上皮，肺泡壁周圍可見少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等(見圖10)，肺部有血栓出現(xiàn)，血管壁增厚，血管周圍被成纖維細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等包裹，支氣管上皮可見大量成纖維細(xì)胞等組成的瘢痕組織(見圖11)，氣管支氣管有些部位形成痘疹，細(xì)胞膨脹空泡變性，在細(xì)胞內(nèi)可見嗜酸性包涵體，痘疹周圍可見漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，在支氣管、肺泡壁周邊可見少量嗜酸性顆粒(見圖12)。

圖8 肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞空泡變性或壞死

注：箭頭示嗜酸性顆粒，三角所示巨噬細(xì)胞吞噬嗜酸性顆粒，比例尺50 μm

圖9 原支氣管上皮組織化生為瘢痕組織，大量炎性細(xì)胞浸潤 注：比例尺50 μm

圖10 肺泡壁增生，大量炎性細(xì)胞浸潤 注：比例尺50 μm

圖11 肺支氣管可見成纖維細(xì)胞等化生形成的瘢痕組織、血管壁增生 注：箭頭示嗜酸性顆粒，比例尺50 μm

圖12 肺支氣管痘疹，膨大的細(xì)胞胞漿內(nèi)可見嗜酸性顆粒 注：箭頭示嗜酸性顆粒，三角示膨大的病變細(xì)胞，比例尺 50 μm

4 討論

目前，羊口瘡作為急性、熱性一類傳染病，不僅具有高傳染性，且具有降低機(jī)體免疫能力易引起繼發(fā)感染，死亡羊只死因多屬于繼發(fā)感染。經(jīng)過病毒分離，特異性PCR擴(kuò)增、測序、比對后發(fā)現(xiàn)，此次分離的重慶2014年株與馬來西亞2014株，2010年KJ610838、KJ610839及KF913722湖北株親緣關(guān)系相近，同屬Ⅱ基因型。其余株系在進(jìn)化關(guān)系上同屬Ⅰ基因型，其中2010同年JQ904790湖北株與前文所述KJ610838、KJ610839及KF913722湖北株屬不同基因型，此重慶2014株與2011年重慶株(JQ904797)也與湖北情況類似先后出現(xiàn)了兩種基因型。綜上所述，近年羊口瘡病毒B2L基因在國內(nèi)共出現(xiàn)兩種基因型，而在2010年湖北出現(xiàn)過兩種基因型病毒株可能由馬來西亞傳播而來，而羊口瘡病毒能夠感染多個物種[7]，既可能來源于羊只交換又可能來源于其他動物攜帶病毒傳染。

對于羊口瘡疾病本身，由于其自限性并不會引起巨大損傷，但其引起的繼發(fā)感染是導(dǎo)致高死亡率的原因[7-8]。此次自然感染狀態(tài)下，須將繼發(fā)感染的病理現(xiàn)象與羊口瘡病毒侵襲機(jī)體病理現(xiàn)象區(qū)分。在以往報(bào)道的有關(guān)嗜酸性顆粒的記載，以包涵體形式存在于細(xì)胞中[9]，而此次自然感染狀態(tài)下，在發(fā)病組織間隙發(fā)現(xiàn)大量嗜酸性顆粒，疑似是大量病毒的集合體因其粒徑大小在2～3 μm之間，故并非出血性特征[10]。此類現(xiàn)象在羊痘病毒感染狀態(tài)下也出現(xiàn)類似狀況，為大量的病毒集合體[11-13]，因羊痘病毒與羊口瘡病毒同屬痘病毒屬，故認(rèn)為，在自然感染狀態(tài)下，羊口瘡病毒與羊痘病毒一樣大量病毒會聚集在一起形成嗜酸性病毒顆粒。圖5中可觀測到病毒嗜酸性顆粒排出的過程，推測病毒聚集后先在細(xì)胞中形成嗜酸性包涵體，之后嗜酸性顆粒破壞細(xì)胞膜并發(fā)生遷移，對其他組織、機(jī)體進(jìn)行感染。

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Molecular diagnosis of natural orf virus and observation of the pathological tissues

WU Xin1, HU Yue1, LI Liang-juan1, HE Jie-yu1, WANG Jia-chen1,PENG Yuan-yi1, WU Jian-yun1,HU Yan1,2

(1.College of Animal Science and Technology, Southwest University,Chongqing 400715, China ;2.MaoZe Science and Technology Ltd, Chongqing 401120, China)

A serious orf transmitted in a goat factory in Chongqing, and the epidemic was controlled by emergency immunization and treatment. The orf infection was determined by PCR and sequencing test between the capripox virus specific gene P32 and the orf virus gene B2L after isolation. Inflammatory cell infiltration and large of eosinophilic bodies were found in the liver, lung and tongue tissues by HE staining of the epidemic samples.

capripox virus ； orf virus ； PCR ； histological observation

WU Jian-yun

2016-01-29

武鑫(1989- )，男，博士生，從事動物疾病病理與組織學(xué)研究，E-mail:wuxinddl@163.com

吳建云，E-mail:jianyun1973@163.com

S858.26

A

0529-6005(2017)02-0014-05