豬流行性腹瀉病毒不同保存方法的比較研究

劉小蘭 ， 張 飛 ， 賀 筍 ， 杜久斌 ， 張 迪 ， 孫彥軍 ， 王鵬江 ， 李延濤

(新疆天康畜牧生物技術股份有限公司， 新疆烏魯木齊830011)

豬流行性腹瀉病毒不同保存方法的比較研究

劉小蘭 ， 張 飛 ， 賀 筍 ， 杜久斌 ， 張 迪 ， 孫彥軍 ， 王鵬江 ， 李延濤

(新疆天康畜牧生物技術股份有限公司， 新疆烏魯木齊830011)

選用新疆地區分離的豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株分別在低溫冰箱(-20 ℃左右)、超低溫冰箱(-80 ℃左右)和液氮(-196 ℃左右)等3種不同保存方法下，保存3、6、9、12個月，對保存的病毒分別進行TCID50測定，以及相同劑量口服接種3日齡易感仔豬試驗，觀察攻毒后仔豬臨床癥狀及發病率。結果表明，豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株保存12個月，低溫冰箱中病毒TCID50從10-5.0降至10-2.0，發病率從100%降至0，臨床癥狀較為輕微；超低溫冰箱病毒TCID50從10-5.0降至10-3.7，發病率從100%降至60%；液氮病毒TCID50從10-5.0降至10-4.7，發病率從100%降至80%，臨床癥狀較為明顯。因此，液氮可以作為該病毒較長時期保存的方法。

豬流行性腹瀉病毒； 病毒保存； 病毒含量(TCID50)； 發病率

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。該病毒是一類保存比較困難的病毒，用一般的方法保存，時間較短，保存不當極易造成該病毒的死亡。有效的保存分離毒株是對PEDV進行進一步研究的基礎。本文詳細分析了PEDV在不同溫度下保存不同時間后其病毒毒力的變化及對仔豬的感染效果，為更好的研究該病毒以及可行性疫苗等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒種 豬流行腹瀉病毒XJ-DB2株，由新疆天康畜牧生物技術股份有限公司分離、鑒定、保管和供應。

1.2 Vero細胞 Vero細胞，購自中國獸醫藥品監察所，由新疆天康畜牧生物技術有限公司鑒定、保存和供應。

1.3 培養基 MEM，購自Thermo Scientific科技有限公司。

1.4 設備 CO2細胞培養箱(型號3111)；低溫冰箱；超低溫冰箱，均購自Thermo Scientific科技有限公司；液氮罐(型號CHART)，購自查特生物醫療(成都)有限公司。

1.5 方法

1.5.1 毒源(種)制備 選取本實驗室保存的從新疆地區某豬場分離得到的豬流行性腹瀉病毒，在病毒的純凈性、特異性檢驗后在Vero細胞上連續穩定傳代至第16代，病毒滴度為10-5.0TCID50/mL。1.5.2 保存方法 將第16代XJ-DB2株分裝至2 mL無菌離心管中，分3份，每份10管，分別置低溫冰箱、超低溫冰箱和液氮中保存。3種保存方法的保存期設為3、6、9、12個月。XJ-DB2株在不同溫度下保存3、6、9、12個月后取樣，進行病毒滴度和對靶動物的致病性的檢測。

1.5.3 病毒滴度TCID50的測定

1.5.3.1 準備細胞 取出一塊96孔細胞培養板，每個孔的細胞鋪成單層，大約60%豐度即可，選取16個孔作為細胞對照。取生長良好的Vero細胞用胰酶消化后，用MEM將細胞密度調整約為1×106/mL，將調整后的細胞加入96孔板中，每孔加100 μL，然后至37 ℃含5%CO2的培養箱中培養過夜。1.5.3.2 待測病毒液的稀釋 定期將保存在不同溫度下的豬流行性腹瀉XJ-DB2株病毒液取樣，用MEM進行10倍系列稀釋，每個稀釋度分別接種于1.5.3.1中制備的長滿單層的96孔細胞版，100 μL/孔，同時設陰性細胞對照8孔。1.5.3.3 培養 將96孔培養板放置于36 ℃-37 ℃含5%CO2的培養箱中培養5～7 d。

1.5.3.4 結果判定 取出培養板，顯微鏡下觀察細胞病變。按Reed-Muench法計算半數細胞感染量(TCID50)，見表1。

表1 Reed-Muench法計算半數細胞感染量 (TCID50)

計算公式為：距離比例=(高于50%的病毒率的百分數-50%)/(高于50%的病毒率的百分數-低于50%的病毒率的百分數)：即：=(91.6-50)/(91.6-40)=0.8;

logTCID50=距離比例×稀釋度對數之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數即：=0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1 mL;

即：將病毒懸液作10-3.8稀釋后，接種細胞0.1 mL，可以使50%的細胞產生CPE。

1.5.4 易感動物攻毒試驗 定期選取3日齡健康易感仔豬(豬流行性腹瀉病毒抗體為陰性)隨機分組，設攻毒組和對照組，每組5頭。攻毒組口服相同劑量的在不同溫度條件下保存不同時間的豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株，對照組口服相同劑量的細胞培養基。逐日觀察接種仔豬及對照仔豬的排便情況，并逐頭檢查仔豬的肛門是否紅腫和有無糞便污染。若仔豬肛門紅腫(或被糞便污染)，則記為腹瀉，并根據糞便形狀按仔豬腹瀉評分標準[2]做好記錄。

2 結果

2.1 豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株不同溫度，不同保存時間病毒TCID50檢測結果 見表2、圖1。

2.2 易感仔豬攻毒后試驗結果

2.2.1 仔豬腹瀉評分標準 見表3。

表2 病毒檢測時間及TCID50結果

表3 仔豬腹瀉評分標準

2.2.2 攻毒后仔豬臨床評分及發病率 用不同溫度，保存不同時間的豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株對易感仔豬進行口服攻毒，攻毒后每日觀察仔豬臨床癥狀，并對試驗仔豬進行臨床評分，做好詳細記錄，結果見表4。

2.2.3 剖檢結果 易感仔豬攻毒7 d后剖殺，口服在液氮中保存12個月毒株的仔豬，24 h之后表現為腹瀉、嘔吐、震顫等典型的豬流行性腹瀉癥狀，剖殺后可見小腸腸管擴張，內容物稀薄，呈黃色，腸壁弛緩，變薄有透明感。低溫冰箱保存6個月以上攻毒組仔豬的癥狀較為輕微，剖檢結果與陰性對照組十分相似。

從表4的結果可以看出，液氮保存方法能夠保持豬流行性腹瀉病毒XJ-DB2株的高致病率長達12個月之久，可以作為PEDV的較長時期保存的方法；而超低溫冰箱可以作為短期保存PEDV的方法；低溫冰箱保存時，發病率及病毒TCID50在短時間內會明顯降低，所以不作為PEDV的保存方法。若要長期保存豬流行性腹瀉病毒則應保存在液氮中。

表4 不同溫度，保存不同時間仔豬攻毒后臨床評分及發病率

3 討論

本試驗中PEDV保存期設置了12個月，在液氮中保存12個月之后的豬流行性腹瀉病毒的TCID50和對仔豬的高致病率說明該病毒在液氮中還可以保存更長的時間。病毒保存的目的不僅要保持毒株原有的毒力、優良的繁殖性能、穩定的形態特征，并使其遺傳性狀從分離時或從實驗室開始就一直保持不變[2]。

一種良好的病毒保存方法，首先應能保持病毒的優良性狀不變，同時還須考慮方法的通用性和操作的簡便性。具體的菌種保藏方法很多，其原理和應用范圍各有側重，優缺點也有所差別。在病毒保存方法的研究中，真空冷凍干燥法是目前應用最廣泛、效果較好的一種病毒保存方法。該試驗在冷凍前未經干燥處理，若先冷凍干燥處理再用超低溫或液氮保存，效果可能更好，保存時間也會更長，這將有待進一步研究。

[1] Kelly D J,Brien J O,Mccracken K J.Effect of creep feeding on the incidence,duration and severity of post-weaning diarrhoea in pigs[J].Research in Veterinary Science,1990,49(2):223-228.

[2] Kocherhans R,Bridgen A,Ackermann M,etal.Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronaviras(PEDV)genomesequence[J].VirusGenes,2001,23(2):137-144.

2016-04-13

劉小蘭(1982- )，女，獸醫師，本科，從事動物疫苗研發工作，E-mail：122830140@qq.com

S852.65+1

A

0529-6005(2017)02-0042-02