單味中草藥對雞致病性綠膿桿菌體外抑菌試驗

李蘊玉， 張召興， 賈青輝， 常超越， 吳同壘， 張香齋， 張志強， 張艷英， 史秋梅， 李佩國

(河北科技師范學院動物科技學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室 ， 河北秦皇島066604)

單味中草藥對雞致病性綠膿桿菌體外抑菌試驗

李蘊玉， 張召興， 賈青輝， 常超越， 吳同壘， 張香齋， 張志強， 張艷英， 史秋梅， 李佩國

(河北科技師范學院動物科技學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室 ， 河北秦皇島066604)

為了研究23種單味中草藥對雞綠膿桿菌分離株及標準株的體外抑菌試驗效果。方法：利用水提法制備中藥藥液，濃度為1 g/mL；利用平板瓊脂打孔法測定抑菌圈直徑大小；試管二倍梯度稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明，雞綠膿桿菌對五味子、烏梅、五倍子等7種藥物極度敏感，對秦皮高度敏感，對厚樸中度敏感；五味子、烏梅、五倍子等7種藥物MIC在31.25～61.25 mg/mL之間；秦皮、厚樸、紫花地丁MIC 125～250 mg/mL；其余的藥物不敏感。結(jié)論：篩選出五味子、烏梅、五倍子等7種藥物對雞綠膿桿菌有較好的抑菌效果，為雞綠膿桿菌病中藥防治提供理論基礎。

雞 ； 綠膿桿菌 ； 中草藥 ； 體外抑菌試驗

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)又稱銅綠假單胞菌，假單胞菌屬成員，屬于機會性致病菌。該菌在自然界中廣泛的分布在水、土壤以及空氣中。P.aeruginosa是人獸共患致病菌，可以引起人的尿道感染以及肺炎，也可引起雞、水貂、狐貍、貉、羊等多種動物的急性感染，造成動物臟器膿腫[1-2]。張香齋等[3]報道，該菌可以感染不同階段的雞，尤其 1～5日齡的雛雞易感，具有很高的死亡率。由于環(huán)境不利因素及不合理的飼養(yǎng)管理等導致該病的發(fā)生。近幾年，雛雞綠膿桿菌病的發(fā)病率呈上升的趨勢，給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。

在養(yǎng)雞過程中抗生素的不合理使用，使P.aeruginosa的抗藥性問題日漸上升，也造成大量的藥物殘留，嚴重威脅人類的健康[1]。天然植物或者中草藥的提取物可直接作用機體的病原菌具有直接殺滅作用，并且能夠提高機體免疫力，中草藥的使用可以降低抗生素類藥物殘留，減少耐藥性產(chǎn)生的幾率。

本試驗對從臨床分離的雞致病性綠膿桿菌進行體外抑菌試驗，以標準菌株ATCC27853作為質(zhì)控菌株。利用平板瓊脂打孔法和試管二倍稀釋法，篩選出雞致病性P.aeruginosa敏感的中藥，為雞致病性P.aeruginosa中藥防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 雞致病性P.aeruginosa臨床分離菌株H1、H2、標準菌株ATCC27853，均由河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室提供。

1.2 試劑及儀器 黃芩、訶子、蘇木、厚樸、五倍子、紫花地丁、夏枯草、五味子、烏梅、秦皮等23種中藥均購自(秦皇島民樂醫(yī)藥)；普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，均購自上海華美生物公司；常規(guī)試劑及儀器由本實驗室提供。

1.3 菌液的制備及計數(shù) 將綠膿桿菌臨床分離株H1、H2及標準菌株ATCC27853的菌種復蘇，接種于普通培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，挑取菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。利用平板菌落計數(shù)法進行菌落計數(shù)。1.4 中草藥藥液的制備 稱量各單味中草藥100 g后，分別在盛有蒸餾水的器皿中浸泡1 h，再分別進熬藥器皿中，加入500 mL的水，煮開后文火煎0.5 h左右，濃縮原藥液量到100 g；即每毫升含原生藥1 g。然后用120目的篩絹網(wǎng)加上脫脂棉除去中草藥殘渣并將其過濾到150 mL的燒杯中，121 ℃高壓滅菌后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?.5 單味中草藥抑菌效果測定 采用平板瓊脂打孔法，確定中藥抑菌圈的直徑的大小。通過平板菌落計數(shù)法將菌液的濃度調(diào)至到108CFU/mL，取0.1 mL均勻進行涂板，待菌液完全被吸收，用6 mm打孔器，進行打孔，每孔內(nèi)加入1 g/mL中藥液體，以加滿而不溢出孔外為宜。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，測量抑菌圈直徑，每種藥物的藥敏試驗重復3次，取其平均值。參考相關文獻[4]判定標準：抑菌直徑≥20 mm為極敏；抑菌直徑≥15 mm為高敏；抑菌直徑≥10 mm為中敏；10 mm以下為低敏。1.6 單味中草藥最小抑菌濃度(MIC)測定 按照采用試管二倍稀釋法進行，確定中藥最小抑菌濃度(MIC)[5]。取無菌的試管10支進行編號，每管加入營養(yǎng)肉湯2 mL,在第一管內(nèi)加入中藥液2 mL，取出2 mL放入第二管，以此類推，稀釋到第9管，棄去2 mL，即藥物的濃度為(1 g/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.81 mg/mL、)第10管做空白對照，在1～10管加入菌液10 μL(108CFU/mL)，每種藥做3個平行，取其平均值，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽分區(qū)劃線法將10個稀釋不同梯度的試驗菌液接種于普通培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。無菌生長的區(qū)域為該藥的最小的抑菌濃度(MIC)。3次試驗取平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 單味中草藥抑菌圈直徑的大小結(jié)果 由表1可知，分離株H1、對黃芩、訶子、蘇木、五倍子、五味子、烏梅6種藥物極度敏感；對夏枯草、秦皮2種藥物高度敏感；對厚樸中度敏感；對紫花地丁低度敏感；其余不敏感。分離株H2對訶子、蘇木、五倍子、夏枯草、五味子、烏梅6種藥極度敏感；對黃芩、秦皮2種藥高度；對厚樸中度敏感，對紫花地丁低度敏感；其余的藥物對臨床分離株H1、H2及標準菌株均沒有效果。

2.2 單味中草藥最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果 由表2可知，分離株H1，五味子、烏梅、五倍子、訶子等6種藥物MIC在31.25～62.5 mg/mL之間，夏枯草、秦皮、紫花地丁MIC在125 mg/mL，厚樸MIC為250 mg/mL。分離株H2，五味子、烏梅、蘇木、訶子等5種藥MIC在31.25～62.5 mg/mL之間，黃芩、秦皮、紫花地丁、五倍子MIC在125 mg/mL，厚樸MIC為250 mg/mL，其余的藥物對臨床分離株H1、H2及標準菌株均沒有效果。

3 討論

P.aeruginosa是一種重要的人獸共患致病菌，污染了該菌的肉、蛋等食品可能導致人們的食物中毒，并感染人泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)，嚴重的威脅人類的健康[1]。陳紅梅等報道了[6]從死番鴨分離的P.aeruginosa，具有很強的致病性，對多種抗生素具有耐藥性。眾所周知，P.aeruginosa的耐藥性是困擾其防控的難點所在。利用中藥逐漸代替抗生素對該菌引發(fā)疾病的防治，對于減少細菌耐藥性的產(chǎn)生和減少抗生素在肉、蛋等食品中抗生素藥殘具有重要意義。

表1 中草藥對雞致病性綠膿桿菌的體外抑菌試驗/mm

藥物名稱平均抑菌圈直徑(H1)平均抑菌圈直徑(H2)ATCC27853黃芩20518521訶子212322蘇木21523521厚樸14512511五倍子23524521紫花地丁9597夏枯草1720515五味子2726522烏梅25524521秦皮16515515黃蓮---黃柏---白頭翁---連翹---貞子---當歸---甘草---魚腥草---金銀花---大青葉---陳皮---苦參---決明子---

表2 中藥對雞致病性綠膿桿菌的MIC

(單位：mg/mL)

本試驗通過對臨床分離的雞致病性P.aeruginosa單味中藥進行抑菌試驗，結(jié)果表明，P.aeruginosa對五味子、烏梅、五倍子、訶子等7種藥物極度敏感。類似地，張傳美等[7]等報道了采用打孔法對16種中藥對水貂的P.aeruginosa及標準株進行體外抑菌試驗，結(jié)果顯示五倍子、五味子、訶子、烏梅等極度敏感，與本試驗結(jié)果一致；其余的藥物與本試驗的結(jié)果存在一定的差異，可能與該菌的感染的宿主(水貂、雞)不同，其對中藥的敏感性存在的一定的差異。陳娟等[8]報道了采用平板稀釋法從10種清熱解毒類中藥中篩選出五倍子、蒼術(shù)、馬齒莧、射干、蒲公英和金銀花對臨床分離的綠膿桿菌及標準菌株具有較強的抑菌作用。何先元等[9]報道了黃連、蒲公英、赤芍、胡黃連等8種清熱類中藥對P.aeruginosa的抑菌作用。諸如此類的相關研究表明，多種中藥對P.aeruginosa有很強的抗菌作用，某些中藥甚至在低濃度含量下對該菌也具有一定的殺菌效果[10]。因此，中藥防控雞綠膿桿菌病具有非常廣闊的前景。

[1] 房海,陳翠珍.中國食物中毒細菌[M].北京:科學出版社,2014：502-510.

[2] 周學章,田東林,鄧旭明.雛雞綠膿桿菌病病原菌的分離和鑒定[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2004，23(3):19-21.

[3] 張香齋,張艷英,李蘊玉，等.雞源綠膿桿菌的分離鑒定及藥敏試驗.[J].中國畜牧獸醫(yī),2015,42(6):1602-1607．

[4] 徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:65-87.

[5] 陳虹,劉磊,吳潤,等.中草藥復方對畜禽腸道病原的體外抑菌試驗[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009,33(7) :6005-6006．

[6] 陳紅梅,程龍飛,萬春和,等.死亡番鴨中綠膿桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2012,48(12):40-41．

[7] 張傳美,劉海生,楊海燕,等.16種中藥對水貂綠膿桿菌的體外抑菌試驗[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(12):2140-216．

[8] 陳娟,肖洋,池明,等.10種清熱解毒類中藥對綠膿桿菌體外抑菌試驗的研究吉林醫(yī)學[J].吉林醫(yī)學，2012,27(11):1386-1387.[9] 何先元,李坤,喻錄容,等.53 味清熱類中藥對綠膿桿菌抑菌作用的聚類分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2014，20(20): 222-225.[10] 陳林娜,周立勤,王漢敏,等.中藥對臨床耐藥菌株的體外抑菌試驗觀察[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2005，15(1):118-120.

2016-07-04

河北省蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊建設項目(2013—2017)

李蘊玉(1963-)，女，教授，碩士，研究方向為動物疫病防控技術(shù)，E-mail：liyunyu0924@126.com

張召興(1988-)，男，碩士生，研究方向為動物病原微生物及其防控，E-mail：keshiyjszzx0224@126.com

李佩國，E-mail: lpeiguo@163.com

S831

B

0529-6005(2017)02-0052-03

注：張召興與李蘊玉對本文具有同等貢獻