黑猩猩腸道阿米巴原蟲的純化培養及形態觀察

鄒 瑩， 陳 蓉， 章小小， 李俊嫻， 王德云

(1.南京農業大學動物醫學院， 江蘇南京210095 ； 2.南京紅山森林動物園， 江蘇南京210028)

黑猩猩腸道阿米巴原蟲的純化培養及形態觀察

鄒 瑩1， 陳 蓉2， 章小小2， 李俊嫻2， 王德云1

(1.南京農業大學動物醫學院， 江蘇南京210095 ； 2.南京紅山森林動物園， 江蘇南京210028)

1915年，本園1只黑猩猩經常反復出現腹瀉癥狀，糞便鏡檢發現阿米巴原蟲包囊，用藥后病愈。現采集該黑猩猩慢性感染期糞便進行形態學鑒定，發現該黑猩猩為結腸內阿米巴和迪斯帕內阿米巴或溶組織內阿米巴混合感染。使用營養瓊脂雙向培養基進行純化培養成滋養體(后期進行分子鑒定為迪斯帕內阿米巴滋養體)并對其進行形態觀察，為日后鏡檢鑒定提供了依據，并為其分子學鑒定提供了蟲體原料。

1 材料與方法

1.1 培養基配制 本試驗采用經楊光友等人改良后的營養瓊脂雙相培養基[1-2]，其中A固體部分包括牛肉浸膏1.5 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂7.5 g和B部分液體。B液體部分包括NaCl 8 g、KCl 0.2 g、CaCl20.2 g、MgCl20.01 g、Na2HPO42 g、KH2PO40.3 g、蒸餾水1 000 mL。

先配制液體部分，CaCl2和MgCl2分裝于不同的容器，其他液體部分同裝一個容器，高壓滅菌，充分冷卻后混合均勻。取500 mL混合液加入固體部分，沸水浴2～3 h，完全溶解后趁熱分裝試管，每管5 mL。高壓滅菌后趁熱放成斜面，冷卻，放入冰箱中保存備用，余下的500 mL液體保留。接種前，每管中加B部分液體4.5 mL、兔血清0.5 mL、滅菌米粉20 mg、青霉素1 000 lU和鏈霉素2 000 μg。

1.2 糞樣處理與形態觀察 糞樣取自本園的圈養黑猩猩。取新鮮糞樣常規碘染鏡檢，初步鑒定是否有碘染的阿米巴包囊。向盛有50 g糞便的小燒杯加入適量蒸餾水，攪拌至混合均勻，結合260目篩過濾。將濾液于離心機中3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀的糞泥作接種用[3]。吸取處理后的糞樣接種至配好的營養瓊脂雙向培養基，每管100 μL，于37 ℃恒溫培養箱培養，后每24 h取培養液進行1次形態學觀察。出現大量的成熟期四核包囊后，取100 μL培養液接種于新的培養基中促進包囊破解為滋養體及滋養體的繁殖[4-5]。

2 結果

2.1 糞便中阿米巴包囊及囊后滋養體 糞樣直接鏡檢可見未成熟的、成熟的迪斯帕內阿米巴包囊、成熟的結腸內阿米巴包囊以及由于染色質量不高而分辨不出的包囊和囊后滋養體。所見的未成熟迪斯帕內阿米巴包囊多為單核包囊，圓球形，直徑為15 μm左右，有囊壁，1個核，擬染色體和糖原泡染色不明顯(圖1a)。成熟的迪斯帕內阿米巴包囊為感染期包囊，無擬染色體和糖原泡，有4個泡狀核，包囊碘染后呈淡棕色，直徑13 μm左右，內外質分解明顯[6](圖1b)。成熟的結腸內阿米巴包囊(圖1c)包囊較大，10～20 μm，圓球形，染色較淺，可見近8個細胞核，未見到糖原體和擬染色體，可見核仁，內外質分解明顯。核周染色質粒分布不均，核仁大，多偏位。囊后滋養體(圖1d)呈不規則扁圓形，較包囊稍大，直徑約20 μm，不運動，內質與外質分界不明顯。

2.2 培養基中阿米巴包囊與滋養體 培養1周后，培養基中基本變為成熟即將破解逸出的四核迪斯帕內阿米巴包囊[7](圖2a)。接種入新培養基的阿米巴包囊48 h后基本消失，培養基中可見大量運動力不足的滋養體(圖2b)與少數活性強盛快速運動的滋養體(圖2c)，折光性較強。蟲體圓形或橢圓形，直徑9～20 μm，進行二分裂繁殖。內置顆粒小而均勻，細胞核1個，核膜內緣有一層排列整齊的染色質粒，中央有一核仁。能運動的個體大多呈長葫蘆形，具透明偽足，以翻滾、擺動和旋轉的方式行定向運動[8-9]。

圖1 阿米巴包囊與囊后滋養體

a:未成熟迪斯帕內阿米巴包囊(400×)；b:成熟迪斯帕內阿米巴包囊(400×)； c:成熟結腸內阿米巴包囊(400×)；d:囊后滋養體(400×)

圖2 迪斯帕內阿米巴包囊與滋養體

a:成熟迪斯帕內阿米巴包囊(1 000×)； b:運動力不足的滋養體(400×)； c:快速運動的滋養體(400×)

3 討論

阿米巴類感染在動物園動物中發現率不低，尤以靈長類的腸道感染居多[10～12]。腸道阿米巴原蟲，種類雖多，但惟有溶組織內阿米巴被認為有致病力，可引起膿血痢疾、肝膿腫、肺膿腫等病變。因此，不同種腸道阿米巴的形態觀察及鑒別在臨床診斷上有著重要意義。1993年重新劃出的新的種-迪斯帕內阿米巴與溶組織內阿米巴形態相似、生活史相同，從形態上無法鑒定[13]，常誤診。結腸內阿米巴直徑略大于溶組織內阿米巴，在我國與其平行分布，發現時有必要繼續尋找后者[14]。

結腸內阿米巴和迪斯帕內阿米巴在包囊形態上有較為明顯的區別。本試驗有以下總結：兩者包囊都有囊壁，且其未成熟的包囊都常有較大糖原泡，但結腸內阿米巴包囊較大，細胞核1～8個，多為8個，呈亮圈狀。迪斯帕內阿米巴滋養體內質顆粒小而均勻，結腸內阿米巴則含有食物泡。若顯像清楚，可看見迪斯帕內阿米巴核周染色質粒大小均勻，排列整齊，核仁小，多位于中央。結腸內阿米巴則核周染粒粗，排列不規則，核仁也較大，常為偏心位。擬染色體偶見，呈碎片狀。

結腸內阿米巴和迪斯帕內阿米巴能夠通過包囊形態直接區別，但是迪斯帕內阿米巴和溶組織內阿米巴在形態和生活史上相同。此外，迪斯帕內阿米巴是無侵襲性的阿米巴[13]，感染率是溶組織內阿米巴的9倍，過去估計的溶組織內阿米巴感染率中很可能90%屬于迪斯帕內阿米巴感染[6]。因此，在臨床中發現溶組織內阿米巴感染或發病時，注意排除迪斯帕內阿米巴感染，從而指導臨床用藥。

該黑猩猩糞樣直接鏡檢時發現了較大量結腸內阿米巴包囊與一些囊后滋養體，說明其為兩種阿米巴原蟲混合感染。但在接種培養基后，僅迪斯帕內阿米巴生長為滋養體。造成這種現象是由于迪斯帕內阿米巴活力較強，并且所采集為用藥后的糞便，結腸內阿米巴較為敏感，導致純化培養時僅迪斯帕內阿米巴生長。

在眾多阿米巴分離培養基中，僅血清和米粉是不可缺少的。采用傳統的LES培養基多次培養后的阿米巴蟲體會出現生長衰退、偽足變短、蟲體變圓、甚至無繁殖能力等退化現象[15]。經楊光友等人改良后的培養基改進了這一狀況，降低了培養成本，縮短了培養時間，提高了培養質量，其繁殖的滋養體數在48 h后能達到最大值[1-2]。但在本試驗中，繁殖出一定量的滋養體用時較長，并且由糞樣直接培養的培養基內包囊成熟后難以破裂，需再一次接種于新的培養基才能逸出滋養體。其原因是在體內感染時，感染性包囊攝入后需在回腸末端或結腸中性或堿性環境中，通過蟲體運動和腸道內酶的作用才能使蟲體脫囊逸出。本次試驗的糞樣采取并非在宿主發病期，且宿主前期有甲硝唑服用史，糞便中包囊基本為單核包囊，因此包囊前期的培養比較困難，也用時很長。同時，該培養基作為多生態培養基，經過長時間的培養，其pH值下降，甚至變為酸性環境，不利于蟲體脫囊。

迪斯帕內阿米巴與結腸內阿米巴均為無致病力的阿米巴，可見該黑猩猩糞檢見大量阿米巴包囊應該是腹瀉的繼發現象，也不排除蟲體內共生菌致病的可能性。臨床遇見此類情況時，應在對癥治療的同時對蟲體進行鑒定，以確定其是不是真正病原，以免誤診延長病程。此類阿米巴雖無致病力，當也可在動物疾病發生時大量增殖加重病情，因此要注意飼料、飲水衛生，做好消毒與滅蟲，避免不同品種不同個體間的交叉感染。此外，已感染個體的糞便內包囊數量也可做腸道健康狀況的指征，指導獸醫在動物出現臨床癥狀前的預防性用藥。

[1] 楊光友，黃道超，姜波，等. 凹甲陸龜溶組織內阿米巴原蟲病的病原分離培養與鑒定[J]. 中國預防獸醫學報，2007，29(4):248-251.

[2] 姜波.獼猴溶組織內阿米巴原蟲病病原分離鑒定及凝集素hgl基因的原核表達[D].雅安：四川農業大學.2008.

[3] 劉慧，孫曉東，聶仁華，等. 3種方法檢測糞便中溶組織內阿米巴的結果比較[J]. 中國病原生物學雜志，2008，3(9):679-680,789.

[4] Clark C G，Diamond L S. Methods for Cultivation of Luminal Parasitic Protists of Clinical Importance[J]. Clin Microbiol Rev，2002，15(3):329-341．

[5] Thelma H Dunnebacke. The Ameba Balamuthia mandrillaris Feeds by Entering into Mammalian Cells in Culture[J]. J EUKARYOT MICROBIOL，2007，54(5):452-464.

[6] 夏夢巖，高飛，李小靜，等.阿米巴病的實驗診斷研究進展[J]. 國外醫學臨床商務化學與檢驗學分冊，2002，23(2):91-92

[7] 陳建平，王光西. 人體寄生蟲學彩色圖譜[M]. 成都:四川大學出版社，2004:I-5.

[8] 劉鳴一. 在不同條件下溶組織內阿米巴滋養體的形態觀察[J]. 動物學雜志，1988，23(3):1-2.

[9] 崔黎明，劉利，施雨露，等. 溶組織內阿米巴滋養體在液體培養基中運動方式的觀察[J]. 白求恩醫科大學學報，1998，24(6):589.

[10] 李健，全琛宇，施維，等.廣西地區人工馴繁獼猴、食蟹猴胃腸道寄生蟲感染情況的初步調查[J]．實驗動物與比較醫學，2013，33(4):279-284．

[11] 呂向輝，陳旭旭，袁美群，等. 圈養川金絲猴、獼猴腸道寄生蟲感染及其形態觀察[J]. 經濟動物學報，2010，14(2):92-95.

[12] 蔡娟，喬繼英，張旭，等. 陜西圈養珍稀野生動物腸道寄生蟲感染及其形態觀察[J]. 動物學雜志，2009，44(3):63-69.

[13] Myjak Przemyslaw, Kur Józef, Pietekiewicz Halina, Kotlowski Andrzej,etal. Molecular Differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar from Stool and Culture Samples Obtained from Polish Citizens Infected in Tropics and in Poland[J]. Acta Protozool，2000，39: 217-224.

[14] 葉砒婧，姚輝，向左甫. 非人靈長類腸道寄生蟲研究進展[J]. 安徽農業科學，2013，41(12):5384-5388，5391.

[15] 陶紅，施自倫，周麗麗，等. 阿米巴原蟲病的實驗診斷研究進展[J]. 中外健康文摘，2010，29(7):28-30.

2016-04-28

鄒瑩(1991—)，女，碩士生，主要從事動物疾病研究, E-mail: 2015807152@njau.edu.cn

王德云，E-mail: dywang@njau.edu.cn

S852.71

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0529-6005(2017)02-0104-02