基于ITS和trnl-trnF序列的新疆扁桃種質資源親緣關系研究

朱 玲，徐崇志，張 銳，周 燕，高 山

(1.塔里木大學 植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.塔里木大學 生命科學學院，新疆阿拉爾 843300)

基于ITS和trnl-trnF序列的新疆扁桃種質資源親緣關系研究

朱 玲1,2，徐崇志1,2，張 銳2，3，周 燕3，高 山1

(1.塔里木大學 植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.塔里木大學 生命科學學院，新疆阿拉爾 843300)

為探究新疆扁桃種質的親緣關系，以新疆‘紙皮’與‘阿曼尼沙’等24個扁桃種質為材料，對其葉片及果實的植物學性狀進行對比分析。提取總DNA后分別對ITS與trnl-trnF序列進行PCR擴增、純化及測序，將所測序列進行拼接及同源性比對。利用MEGA5軟件構建基于ITS和trnl-trnF序列的不同扁桃種質間的系統發育樹。通過植物學性狀對比發現，‘矮豐’的葉形指數最高為4.12，‘葉爾羌’的出仁率為72.9%，在供試24個扁桃種質中最高。經相關生物信息學軟件分析表明，ITS序列長度為608～610 bp，包括42個變異位點和9個簡約信息位點，G+C含量為61.16%～61.90%。trnl-trnF序列長度為915～933 bp，其變異位點和簡約信息位點豐富，分別為457個和332個，分別占總長的48.8%和35.7%，G+C含量較低，為32.46%～32.94%。基于ITS和trnl-trnF序列的系統發育樹表明，ITS序列間的遺傳距離為0.000～0.008，trnl-trnF序列間的遺傳距離為0.000～0.400，‘雙薄’與‘雙軟’具有相同的遺傳背景。

扁桃；ITS；trnl-trnF；植物學性狀；系統發育

扁桃(AmygdaluscommunisL.)屬薔薇科(Rosaceae)、李亞科(Prunoideae)、桃屬(AmygdalusL.)、扁桃亞屬(Amygdalussubgen.)樹種，又名巴旦杏、美國大杏仁、巴旦姆(新疆)。其作為栽培植物，種仁營養價值很高，并具有藥理特性，是世界著名的干果和木本油料樹種[1]。扁桃原產于中亞、西亞和非洲北部山區，世界上共約有52～53個種[2]。中國新疆也是扁桃原產地之一，在新疆天山山區有野生扁桃林分布，主栽區在新疆南部喀什地區的莎車縣、英吉沙縣、疏附縣、疏勤縣、葉城縣、澤普縣和喀什市[3-4]。扁桃的栽培歷史悠久，至今約有6 000 a，中國的扁桃栽培歷史已逾1 300 a，由于長期的自然演化和自播繁衍，形成豐富的資源[5]。中國扁桃共有6個種，即普通扁桃(A.communisL.)、西康扁桃(A.tanguticaKorsh.)、長柄扁桃(A.pedunculataPall.)、野扁桃(A.ledebourianaSchleche.)、蒙古扁桃(A.mongolicaRicker)和榆葉梅[A.triloba(Lindl.) Ricker]及10個變種[2-3]，本研究供試24份扁桃種質均屬于普通扁桃(A.communisL.)。新疆喀什地區的莎車和英吉沙2個縣，于20世紀70年代建立扁桃品種類型匯集圃，大概有34個扁桃品種類型。近年來，從美國引進‘濃帕爾’、‘布特’和‘卡買爾’等[6]11個扁桃品種。目前新疆本地扁桃種質資源混亂。因此，如何有效地進行種質資源的分子鑒定就成為現階段扁桃種質資源研究的重要目標。

核糖體rDNA ITS(Internal transcribed spacer)序列在基因內保守但因基因間存在一定變異，進化速率較編碼區快且便于設計通用引物，所以常被用來分析植物屬間及屬下水平的系統發育關系[7-8]。葉綠體基因組(Choroplast DNA cpDNA)其遺傳方式為單親遺傳，具有較高的序列保守性且進化速率恒定，葉綠體rDNA trnl-trnF序列片段大小適中，不受功能限制，其進化速率大于功能編碼區，能提供較多系統學意義的信息位點，因此也常被用于植物屬間及屬下水平的系統發育分析[9-10]。楊波等[11]對18個扁桃種質進行遺傳多樣性和親緣關系RAPD分析，結果表明，供試的18個扁桃種質分為2大類，聚類結果與種質分布結果基本一致。呂志江等[12]采用ISSR分子標記技術，對中國新疆分布的野扁桃5個居群共120個個體的遺傳多樣性進行研究。目前，有關結合植物學性狀和核糖體基因及葉綠體基因來分析扁桃親緣的研究較少。邱蓉等[13]以新疆塔城的野扁桃為試驗材料，通過擴增其細胞核ITS序列和葉綠體psbA-trnH序列與GeneBank中下載的矮扁桃的ITS和psbAtrnH 序列進行比對，綜合分析認為野扁桃和矮扁桃為同一個種。本研究采用植物學性狀和核糖體ITS及葉綠體trnl-trnlF序列比對的方法，對新疆喀什地區莎車縣的24個扁桃種質構建系統進化樹，分析其種質間的親緣關系，以期為今后新疆扁桃種質資源的開發、保護及利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗收集并分析了‘紙皮’、‘阿曼尼沙’及‘雙薄’等24個扁桃樣本，均取自新疆喀什地區莎車縣二林場(扁桃種質資源圃)。8月初采樣，隨機選取當年新梢頂端健康成熟葉片及果實，部分葉片在液氮中冷凍保存，備用。

1.2 植物學性狀測定

清洗收集的葉片及果實，將其晾干。利用數顯游標卡尺(精度為0.01 cm)、直尺和電子天平(精度為0.01 g)對扁桃葉片及果實的主要植物學性狀進行測定。利用DPS 6.55軟件對所得數據進行顯著性分析，對比不同扁桃種質間的植物學性狀差異。

1.3 DNA提取

采用CTAB法[14]并加以改良，提取扁桃葉片總DNA，提取的質量用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop2000超微量分光光度計進行檢測，置于-20 ℃的冰箱存放，備用。

1.4 PCR 擴增及基因測序

PCR擴增引物及反應程序如表1所示。PCR的反應體系為20 μL：MgCl21.5 μL，10×buffer 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L正反向引物各0.4 μL，滅菌ddH2O 13.1 μL，Taq酶0.2 μL，DNA 模板2.0 μL。PCR擴增產物先在10 g/L瓊脂糖凝膠上檢測，用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察并拍照查看有無擴增產物，然后將PCR產物送到上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

表1 PCR擴增所用引物及反應程序Table 1 Primers and protocols of PCR

1.5 序列比對分析及聚類

DNA序列的拼接應用SeqMan ( DNASTAR Inc．，Madison，Wisconsin，USA) 軟件，用EditSeq( DNASTAR Inc．，Madison，Wisconsin，USA)軟件對拼接好的序列進行分析，利用MEGA 5軟件進行多重序列的比對并對ITS和trnl-trnlF序列分別構建UPGMA系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 主要植物學性狀比較

對扁桃葉片及果實的植物性狀進行比較(表2和表3)，便于對不同扁桃種質的異同點進行分析。由表2可以看出，大部分扁桃種質的葉形為披針形；‘紙皮’為闊橢圓形；‘葉爾羌’和‘寒豐’為長橢圓形。同時，‘寒豐’和‘巴旦王’的葉長、葉寬及葉柄長度與‘紙皮’和‘阿曼尼沙’等多數扁桃種質相比具有顯著差異。‘矮豐’的葉形指數最高，‘雙果’和‘苦巴旦’次之，‘鷹嘴’的葉形指數最低。由表3可以看出，‘白薄’與‘尖軟’的果實長度較其他種質略長，‘巴旦桃’內果皮厚度最大，‘白薄’次之，‘葉爾羌’的內果皮厚度最小。在本試驗24個扁桃種質中，多數種質內果皮呈淡褐色，‘鷹嘴’和‘晚豐’等少數種質則呈現褐色，而‘白薄’呈黃白色，其內果皮顏色較其他種質偏黃，‘小石子’則呈灰褐色。‘葉爾羌’出仁率最高為72.9%，‘紙皮’出仁率為68.5%排列第2位，‘巴旦桃’的出仁率僅有19.3%，為出仁率最低的種質。

表2 不同扁桃種質葉片比較分析Table 2 Comparative analysis of germplasm leaves of different species in Amygdalus communis

注：同列中不同字母表示樣本之間該指標存在極顯著差異(P<0.01)。下表同。

Note:Differences,different letters in same column indicate significant difference among samples(P<0.01).The same as below.

表3 不同扁桃種質果實比較分析Table 3 Comparative analysis of different germplasm fruits in Amygdalus communis

2.2 核糖體ITS序列比對及系統發育樹的構建

將試驗測得‘紙皮’、‘阿曼尼沙’和‘雙薄’等24個扁桃樣本的ITS序列用EditSeq軟件進行分析。結果表明，ITS序列長度為608～610 bp，G+C含量為61.16%～61.9%。用MEGA5進行多重序列比對，對位后長度為611 bp，包括42個變異位點和9個簡約信息位點。重復次數為1 000 次，構建UPGMA樹(圖1)，結果顯示，在遺傳距離為0.004處，‘巴旦王’、‘巴旦桃’和‘尖軟’親緣關系最近，同時這3個種質又可與‘鷹嘴’、‘白雙’和‘矮豐’等共14個種質聚為一枝，表明其親緣關系較近。‘白薄’和‘尖嘴’聚為一枝，并于‘苦巴旦’構成姐妹群。‘雙薄’和‘晚豐’聚為一枝，并與‘小石子’構成姐妹群。而‘小雙’、‘皮斯特’‘石子’和‘紙皮’各自為一枝，表明這4個扁桃種質與其他種質間的親緣關系較遠。

圖1 MEGA5軟件構建基于ITS序列的扁桃UPGMA樹Fig.1 UPGMA tree of Amygdalus communis based on ITS sequences by MEGA5

2.3 葉綠體trnl-F序列同源性分析及系統發育樹的構建

將試驗測得‘紙皮’ 、‘阿曼尼沙’和‘雙薄’等24個扁桃樣本的trnl-trnF序列拼接后用EditSeq軟件分析表明，trnl-trnF序列長度為915～933 bp，G+C含量為32.46%～32.94%。用MEGA5進行多重序列比對，對位后長度為937 bp，其中包含豐富的變異位點和簡約信息位點，分別為457個和332個，分別占總長的48.8%和35.7%。并構建UPGMA樹(圖2)，重復1 000次。聚類結果表明，24個扁桃種質最終被聚為兩枝，‘雙薄’與‘雙軟’聚為一枝，表明其親緣關系最近，而其他22個則聚為一大枝，表明‘矮豐’、‘巴旦桃’和‘鷹嘴’等22個扁桃種質之間的親緣關系較近，且與‘雙薄’與‘雙軟’的親緣關系較遠。

3 討 論

3.1 主要植物學性狀差異的分析

從植物學性狀對比結果來看，供試24個扁桃種質在葉片外形指標、內果皮外形指標及出仁率方面存在一定差異。‘紙皮’的葉形為闊橢圓形，‘葉爾羌’和‘寒豐’為長橢圓形，這3 個扁桃種質在葉形上與其他種質間存在明顯物種差異性。‘阿曼尼沙’等其余21個扁桃種質的葉形均為披針形，其中‘鷹嘴’和‘矮豐’為長披針形，‘雙果’和‘白薄’為長橢披針形，‘公巴旦’則為卵披針形。在24份扁桃種質中，‘矮豐’的葉形指數最高，達到4.12，‘雙果’和‘苦巴旦’次之，分別為4.06和4.02，‘鷹嘴’的葉形指數最低，為2.27，說明‘矮豐’、‘雙果’和‘苦巴旦’的葉形是供試種質中最為細長的3個種質，而‘鷹嘴’的葉形則既寬又扁。

圖2 MEGA5軟件構建基于trnl-trnF序列的扁桃UPGMA樹Fig.2 UPGMA tree of Amygdalus communis based on trnl-trnF sequences by MEGA5

根據果實外部性狀比較分析可知，在供試24個扁桃種質中，除‘鷹嘴’‘晚豐’‘苦巴旦’‘皮斯特’‘巴旦桃’和‘尖軟’的內果皮顏色為褐色，多數種質內果皮呈淡褐色。‘白薄’呈黃白色，其內果皮顏色較其他種質偏黃，‘小石子’呈灰褐色。‘白薄’與‘尖軟’的果實長度與其他扁桃種質間存在顯著差異，較其他種質略長。‘葉爾羌’出仁率最高為72.9%，‘紙皮’出仁率為68.5%，排列第2位，其內果皮厚度分別為1.03 mm與1.36 mm，是供試扁桃種質中內果皮厚度最小的2個種質，這表明‘葉爾羌’和‘紙皮’的商品性最高。‘巴旦桃’的出仁率僅有19.3%，為供試扁桃種質中出仁率最低的種質，并且其內果皮厚度也為供試扁桃種質中最厚的，說明‘巴旦桃’較難取食，其商品性最低。

3.2 ITS序列及trnl-trnF的分子進化比較分析

在目前對扁桃種質資源及遺傳多樣性的研究中，主要以傳統形態學特征及RAPD與ISSR等分子標記為研究手段。通過核糖體rDNA ITS序列與葉綠體cpDNA trnl-trnF序列基因測序、序列比對及構建系統發育樹來探討果樹植物親緣關系的研究還較少。王化坤等[15]通過測定6個核果類果樹ITS序列，用最大簡約法構建桃、李、梅、杏、櫻桃的系統發育樹。結果發現，核果類果樹ITS1和ITS2的分子進化速率不同和信息量存在差異，桃演化順序為巴旦杏-山桃-普通桃、新疆桃，并支持將核果類果樹分成4個亞屬。本研究依據核基因ITS序列和葉綠體trnl-trnF序列構建24個新疆扁桃不同種質的系統發育樹。供試的24個扁桃種質的ITS及trnl-trnF序列經相關生物信息學軟件分析，結果顯示ITS序列長度為608～610 bp，對位后長度為611 bp，包括42個變異位點和9個簡約信息位點，G+C含量為61.16%～61.90%。trnl-trnF序列長度為915～933 bp，對位后長度為937 bp，其中包含豐富的變異位點和簡約信息位點，分別為457個和332個，分別占總長的48.8%和35.7%，G+C含量較低，為32.46%～32.94%。ITS序列間的遺傳距離為0.000～0.008，trnl-trnF序列間的遺傳距離為0.000～0.400，ITS序列總體遺傳距離較trnl-trnF序列小。在本研究中扁桃ITS序列遺傳距離較小，出現的遺傳變異位點較少，信息含量偏低，說明24種扁桃起源較為相似。相比較而言，trnl-trnF序列則具有豐富的變異位點和簡約信息位點，說明trnl-trnF序列在扁桃中存在豐富的遺傳變異。而趙海光等[16]及陳仁芳等[17]研究表明，在種屬進化關系中ITS序列變異位點高于trnL-trnF，與本研究結論不一致，原因可能在于本研究是同一種內不同地域間扁桃種質的親緣關系，體現了核糖體ITS序列和葉綠體trnL-trnF序列在不同分類水平的鑒別能力。

核糖體上的基因通常為多拷貝數、中度重復序列，1個重復單位由5.8S、18S、26S編碼區以及一些間隔區組成。真核生物核糖體內轉錄間隔區ITS (Internal transcribed spacer) 位于18S和26S基因之間，中部被5.8S分為ITS1區與ITS2區。ITS序列既有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性，說明這些序列很容易在近緣類群間排序，并且因其豐富的變異性可在種間、屬間及屬下水平解決植物系統發育問題。研究表明，在被子植物ITS1區與ITS2區的序列長度變異很小(均小于300 bp)[8]。在探討一些被子植物種間、屬間及屬下水平的系統發育時，ITS區提供的信息對于被子植物系統發育研究是很有價值的，目前已被廣泛地應用于被子植物種間及近緣屬間的系統發育和分類研究中[18-20]。本研究對于扁桃屬不同扁桃種質的ITS序列聚類分析得到，‘巴旦王’、‘巴旦桃’和‘尖軟’聚為一枝，表明其親緣關系最近。同時這3個種質又可與‘鷹嘴’、‘白雙’和‘矮豐’等共14個種質聚為一枝姐妹群，表明其親緣關系較近。‘白薄’和‘尖嘴’聚為一枝，并與‘苦巴旦’構成姐妹群。‘雙薄’和‘晚豐’聚為一枝，并與‘小石子’構成姐妹群。而‘小雙’‘皮斯特’‘石子’和‘紙皮’各自為一枝，表明這4個扁桃種質與其他種質間的親緣關系較遠。

葉綠體DNA(chloroplast DNA，cpDNA)最早是在藻類中發現的，葉綠體基因序列相當保守，其非編碼區DNA進化速率普遍高于功能編碼區。cpDNA遺傳方式為母系遺傳，遺傳性狀穩定，有獨立的進化路線，不依賴于其他任何數據即可構建分子系統進化樹。葉綠體基因trnL-trnF(包括trnL內含子和trnL-F基因間隔區)，在進化上具有選擇壓力小和進化速率較快的特點，較為適合種間的系統發育和遺傳分析[21]，目前cpDNA trnL-trnF已被廣泛用于植物屬間、種間關系的鑒別。如宮霞等[22]利用葡萄trnL-trnF的序列，對于葡萄科各屬間的分子系統學進行了研究。本試驗利用葉綠體基因通用引物對24種扁桃樣品進行擴增，測序結果采用相關生物信息學軟件進行序列拼接、比對及系統發育樹構建。根據葉綠體基因母系遺傳的特點，可以推測‘矮豐’、‘巴旦王’和‘鷹嘴’等22個扁桃種質具有相同的遺傳背景，而‘雙薄’與‘雙軟’則可能為同一母本。

綜上所述，從植物學性狀對比結果來看，供試24個扁桃種質在葉片外形指標、內果皮外形指標及出仁率方面存在差異。利用ITS序列及trnL-trnF序列對供試24個扁桃種質構建系統發育樹，聚類結果明顯不同。利用ITS序列所構建的系統發育樹可聚為多枝，并且‘雙薄’與‘雙軟’種質親緣關系較遠。而基于葉綠體trnL-trnF序列構建的系統發育樹中‘雙薄’與‘雙軟’能夠聚為一枝，說明它們具有相同的遺傳背景。有研究表明被子植物中葉綠體DNA的進化速率比核糖體DNA低[23]，這可能是導致本研究中ITS序列和trnL-trnF序列構建的系統發育樹有差異的原因。

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(責任編輯：潘學燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Study on Genetic Relationship ofAmygdaluscommunisPopulations Based on ITS and trnl-trnF Sequences

ZHU Ling1,2,XU Chongzhi1,2,ZHANG Rui2,3,ZHOU Yan3and GAO Shan1

(1.College of Plant Sciences,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China；2.Key Laboratory of Protection and Utilization of Bological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps,Alar Xinjiang 843300,China； 3.College of Life Sciences,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

The purpose of the paper is to explore the genetic relationship and germplasm resources ofAmygdaluscommunisin Xinjiang for providing a scientific basis for protection and utilization in the future.With ‘Zhipi’ and ‘Amannisha’ and the other 24Amygdaluscommunisvarieties in Xinjiang as materials,and then we compared and analysed its botanical characters in leaves and fruits.After the total DNA was extracted,the ITS and trnl-trnF sequences were respectively amplified and sequenced.These sequences were joined together,then the homology of the sequences were compared.Using MEGA5 software to build the phylogenetic tree of differentAmygdaluscommunisvarieties based on ITS trnl-trnF sequences.Compared with botanical properties,the results found that ‘Aifeng’ had the highest leaf shape index of 4.12,the highest kernel percentage was 72.9% in ‘Yeerqiang’,it was the highest in the selected 24Amygdaluscommunisgermplasm resources.The analysis by related bioinformatics software showed that ITS was in 608-610 bp sequence length,including 42 mutation loci and 9 simple information sites,G+C content was at 61.16%-61.90%.Sequence length of trnl-trnF was in 915-933 bp and it had abundant variation and simple information sites which was 457 and 332 respectively,accounting for 48.8% and 35.7% of the total length respectively,its G+C content was low at 32.46%-32.94%.ITS and trnl-trnF sequences and,phylogenetic tree showed that the genetic distance between ITS sequence was between 0.000-0.008,genetic distance between trnl-trnF sequences was between 0.000-0.400,‘Shuangbao’ and ‘Shuangruan’ had the same genetic background.

Amygdaluscommunis; ITS; trnl-trnF; Botanical characters; Phylogenetic analysis

ZHU Ling,female,master student.Research area:fruit genetics and breeding.E-mail:bettyzl2015@163.com

GAO Shan,male,master,associate professor.Research area:cultivation techniques of agroforestry.E-mail:1227081916@qq.com

日期：2017-03-03

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0834.062.html

2016-02-20

2016-03-20

新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室開放基金課題(BRYB1007)。

朱 玲，女，在讀碩士，研究方向為果樹遺傳育種。E-mail:bettyzl2015@163.com

高 山，男，碩士，副教授，主要從事林農間作高效栽培技術研究。E-mail：1227081916@qq.com

S662.9

A

1004-1389(2017)03-0412-08

Received 2016-02-20 Returned 2016-03-20

Foundation item Open Fund Project of Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Bio-resources in Tarim Basin(No.BRYB1007).