無精子癥患者單精子卵胞漿內注射臨床結局的男方相關因素分析

左陽花 仲紀祥 邱峰龍 馮播 薛惠英 張繼躍

單精子卵胞漿內注射(introcytoplasmic sperm injection,ICSI)是把一條可用精子制動后直接注射到卵母細胞的胞漿內使卵母細胞受精的技術，無精子癥是ICSI的絕對適應癥。1994年Devroey等[1]首次報道睪丸手術取精成功用于ICSI，這項技術的成功使得梗阻性和部分非梗阻性的無精子癥患者有獲得自己生物學后代的可能。自從睪丸穿刺(TESE)的精子成功用于ICSI以來，學者們一直在探索影響ICSI臨床結局的可能因素。本文主要是評價男方年齡、發病原因(梗阻性無精子癥或非梗阻性無精子癥)以及精子來源(新鮮或冷凍)等因素對ICSI臨床結局的影響。

對象與方法

1.對象：回顧分析2012年12月至2015年12月在本生殖中心107例行ICSI的無精子癥患者，入組條件為(1)女方年齡28～35歲；(2)男方無精子癥但TESE能找到可用精子。排除標準為女方因素不孕。如子宮畸形、中重度子宮內膜異位癥、輸卵管積水等。共計納入107例患者，根據男方年齡分為A組(<30歲)、B組(30≤～≤40歲)和C組(>40歲)；根據病因分為梗阻性無精子癥(OA)組和非梗阻性(NOA)組；根據精子來源分為新鮮組和冷凍組；分別分析影響ICSI結局的相關因素。本研究經過本院倫理委員會通過，且所有研究均知情同意。

2.促排卵治療：采用本中心常規促排方案進行促排卵治療，B超監測卵泡，當1～2個卵泡直徑≥18 mm，或3個以上卵泡直徑≥17 mm或4個以上卵泡直徑≥16 mm，當天晚上肌注hCG10 000 U(麗珠制藥)或者重組人絨促性素注射液(德國默克雪蘭諾，批準文號：S201230091，規格型號：250 μg)1支，36 h后取卵。

3.精子處理：(1)新鮮穿刺的睪丸精子。將所取睪丸曲細精管置培養皿中用G-IVF(Vitrolife,瑞典)洗滌2次，用2個1 ml無菌注射器(需將其針頭折平)相互碾碎組織，靜置后于倒置顯微鏡下觀察并紀錄結果。將組織碎片和洗滌液一起300 g離心10 min。去上清，用1 ml G-IVF液體混勻沉淀，裝于5 ml小試管中，置于室溫下備用，用之前30 min于培養箱中復溫。(2)冷凍睪丸精子處理。將凍存管置于37℃水浴箱10 min，融解后用培養液稀釋，經離心洗滌去除冷凍保護劑，然后將沉淀懸浮于小滴培養液中，即可用于ICSI。

4.ICSI操作：取卵后培養4 h，在體視鏡下先將卵子放入80 U/ml的Hyluronidase(SAGE，美國)消化酶中，不斷輕輕吹吸，作用30 s后，用不同口徑的用巴氏吸管吹吸，脫除顆粒細胞后將其轉移到G-1(Vitrolife，瑞典)中培養1 h，行ICSI。

5.胚胎觀察和胚胎移植：ICSI后卵子置于覆蓋油的G-1(Vitrolife,瑞典)微滴中培養，16～18 h后觀察受精情況，44 h和68 h看胚胎分裂情況，并選擇可用胚胎進行移植。

6.統計學處理：應用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計數資料采用百分率表示，計量資料采用均數±標準差表示，P<0.05為差異有統計學意義。其中，胚胎種植率=種植胚胎總數/移植胚胎總數×100%；臨床妊娠率=妊娠總人數/移植總人數×100%；活產率=分娩活嬰(雙、多胎按1個計算)/移植周期數×100%；流產率=(早期流產數+晚期流產數)/臨床妊娠數×100%。

結果

1.不同年齡組患者ICSI臨床結局比較：男方年齡<30歲組的女方年齡為(29.8±1.8)歲，基礎FSH(7.4±1.8)U/L，BMI指數(22.7±3.5)kg/m2，內膜厚度(11.4±1.7)mm，成熟卵數(9.9±2.4)個；30≤男方年齡≤40歲組女方年齡為(30.4±2.5)歲，基礎FSH(7.3±1.9) U/L，BMI指數(22.3±3.2)kg/m2，內膜厚度(11.2±1.8)mm，成熟卵數(9.2±2.1)個；男方年齡>40歲組女方年齡為(32.4±2.8)歲，基礎FSH (7.0±1.7)U/L，BMI指數(23.2±3.3)kg/m2，內膜厚度(11.0±2.6)mm，成熟卵數(8.4±2.2)個，三組的女方年齡、基礎FSH、BMI指數、內膜厚度以及成熟卵數比較差異均無統計學意義。不同年齡組患者正常受精率、卵裂率、優質胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率、流產率比較差異也均無統計學意義。見表1。

表1 男方年齡與臨床ICSI結局的關系

臨床妊娠妊娠總人數移植總人數臨床妊娠率(%)活產分娩活嬰數移植周期數活產率(%)流產流產數臨床妊娠數流產率(%)193063 3173056 621910 5213560 0183551 42219 5264261 9224252 332611 5

2.不同病因組ICSI臨床結局比較：NOA組患者女方年齡(30.8±2.1)歲，基礎FSH (7.2±1.9)U/L，BMI指數(22.5±3.2)kg/m2，內膜厚度(11.1±1.9)mm，成熟卵數(9.2±2.3)個；OA組患者女方年齡(31.2±2.3)歲，基礎FSH (7.3±2.1)U/L，BMI指數(22.7±3.4)kg/m2，內膜厚度(11.3±1.9)mm，成熟卵數(9.3±2.4)個。兩組患者女方年齡、基礎FSH、BMI指數、內膜厚度以及成熟卵數數據比較，差異無統計學意義。NOA組和OA組患者正常受精率、卵裂率、優質胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率、流產率數據比較，差異無統計學意義。見表2。

表2 不同病因組臨床結局比較

臨床妊娠妊娠總人數移植總人數臨床妊娠率(%)活產分娩活嬰數移植周期數活產率(%)流產流產數臨床妊娠數流產率(%)345561 8295552 743411 8325261 5285253 83329 4

3.不同精子來源組ICSI臨床結局比較：新鮮精子組患者女方年齡(30.9±2.6)歲，基礎FSH(7.1±2.2 )U/L，BMI指數(22.4±3.1)kg/m2，內膜厚度(11.0±1.8)mm，成熟卵數(9.0±2.2)個；冷凍精子組患者女方年齡(31.1±2.2)歲，基礎FSH(7.4±2.2)U/L，BMI指數(22.8±3.6)kg/m2，內膜厚度(11.4±2.2)mm，成熟卵數(9.4±2.3)個。兩組患者女方年齡、基礎FSH、BMI指數、內膜厚度以及成熟卵數數據比較，差異無統計學意義。新鮮精子組和冷凍精子組患者正常受精率、卵裂率、優質胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率、流產率數據比較，差異無統計學意義。見表3。

表3 不同精子來源組ICSI妊娠結局比較

臨床妊娠妊娠總人數移植總人數臨床妊娠率(%)活產分娩活嬰數移植周期數活產率(%)流產流產數臨床妊娠數流產率(%)355761 4315754 43358 6315062 0265052 043112 9

討論

無精子癥一般是指患者的精液中沒有精子，最新版世界衛生組織在男性不育的診斷檢查及處理手冊指明無精子癥是指精液即使經過離心后檢查亦不能發現精子。但是精液中未發現精子也不代表無精子癥患者完全無法生育后代，部分無精子癥患者，如輸精管缺如、逆行射精或排精障礙的患者可通過睪丸或附睪穿刺獲得精子，并通過ICSI技術來生育后代。經過近20年的發展，目前睪丸或附睪穿刺取精聯合ICSI治療梗阻性或者非梗阻性無精子癥已經在輔助生殖技術領域得到廣泛運用[2]，并取得良好的治療效果。

本研究的目的是探索男方年齡、發病原因(梗阻性無精子癥或非梗阻性無精子癥)以及精子來源(新鮮或冷凍)等因素對ICSI臨床結局的影響。近年來，女方年齡一直被認為是不孕和輔助生殖治療失敗的重要原因，因為女性隨著年齡的增長，卵巢里的儲備卵泡逐漸消失[2]，卵子的質量也在下降。然而本研究結果提示男方年齡對ICSI的結局沒有影響，無精子癥的病因也不影響受精率、卵裂率、臨床妊娠率、活產率及流產率，這與相關學者[3]研究結論一致，也有其他學者的研究發現OA患者的受精率和臨床妊娠率顯著高于NOA患者，認為其主要原因是由NOA患者精子染色體的異常發生率增高所致[4]。有一些研究表明NOA患者采用新鮮精子和冷凍精子在ICSI結局方面無顯著差異[5-6]，NOA患者并不能保證每次TESE都能找到精子，因此利用診斷穿刺時的冷凍精子行ICSI可以避免反復外科穿刺手術；這樣不但能夠減少反復穿刺對患者睪丸功能的影響，還能夠減輕患者的焦慮情緒和經濟負擔[7]。也有研究認為新鮮精子來源的ICSI結局較好，冷凍精子會導致較低的受精率和臨床妊娠率[8]，認為可能與睪丸來源的精子比自然排出的精子對低溫更敏感有關[9]，冷凍過程中精子細胞內冰晶形成會導致頂體和細胞膜腫脹、破裂，同時在精子冷凍和解凍過程中氧自由基增加，導致細胞膜發生脂質過氧化作用，進而影響胚胎質量和妊娠結局。

在臨床上，OA患者幾乎100%能獲得可用精子，而NOA患者只有50%的機會獲得可用精子[10]。因此，對于NOA患者只要TESE獲得可用精子，建議患者進行冷凍保存，以降低取卵周期發生無精子使用的風險。而對于OA患者，建議于取卵日行TESE，可以減少精子冷凍保存費用。

總之，本研究結果表明，無精子癥患者一旦獲得可用精子，ICSI臨床結局不受男方年齡、病因及精子來源的影響。由于本研究標本量較少，有關男方因素對無精子癥患者ICSI臨床結局的影響有待大樣本研究的進一步完善。

1 Devroey P,Liu J,Nagy Z,et al.Normal fertilization of human oocytes after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection.Fertil Steril,1994,62:639-641.

2 鄭菊芬,王鵬,盧永寧,等.無精子癥和嚴重少/弱精子癥ICSI子代與其他精子ICSI/IVF子代出生缺陷的比較研究.生殖與避孕,2015,35:762-766.

3 Gougeon A.The biological aspects of risks of infertility due to age:the female side.Rev Epidemiol Sante Publique, 2005,53 :237-245.

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8 Wasilewska K,Zasiadczyk,Fraser L,et al.The benefits of cooling boar semen in long-term extenders prior to cryopreservation on sperm quality characteristics.Reprod Domest Anim,2016,51:781-788.

9 彭向杰,王斯洋,范立青,等.精液長時間冷凍儲存與冷凍復蘇率的相關性研究.中國現代醫學雜志,2015,25:101-103.

10 Gürler H,Malama E,Heppelmann M,et al.Effects of cryopreservation on sperm viability,synthesis of reactive oxygen species,and DNA damage of bovine sperm.Theriogenology,2016,86:562-571.