熒光原位雜交技術檢測肺癌ROS1易位病例臨床病理特點

陳敏 劉曉羽 呂麗霞 楊潔亮 王威亞

熒光原位雜交技術檢測肺癌ROS1易位病例臨床病理特點

陳敏 劉曉羽 呂麗霞 楊潔亮 王威亞★

目的總結ROS1（c?ros oncogene1）易位病例分子病理特點及治療情況；探討熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術在肺癌ROS1基因檢測中的價值。方法采用熒光原位雜交方法檢測613例肺癌患者ROS1基因。ROS1易位樣本行手工ROS1免疫組化（IHC）、ALK Ventana全自動免疫組化及EGFR突變檢測。結果采用ROS1 FISH法檢出19例陽性病例，檢出率為3.1%（19/613）。陽性細胞平均比例為60%，范圍35%～78%。陽性病例顯示兩種信號模式，其中63.2%（12/19）為經典紅綠分離，36.8%（7/19）為單獨綠色。19例陽性病例ROS1蛋白表達為：1例（5%）0+，2例（11%）1+，7例（37%）2+，9例（47%）3+。陽性病例均無ALK基因易位，除1例同時具EGFR 19外顯子突變外，其余病例均為EGFR野生型。ROS1易位患者年齡略小；女性、非吸煙患者比例較高；大多為晚期病人。組織學類型以實體、腺泡及乳頭型腺癌為主。易位病例中，3例患者死亡，7例患者接受克唑替尼治療。結論ROS1易位更易發生在年輕、女性、不吸煙的腺癌患者中。FISH方法可有效地檢測肺癌ROS1基因易位，對確診ROS1陽性肺癌具有重要意義。

非小細胞肺癌（NSCLC）；ROS1易位；熒光原位雜交（FISH）

肺癌是目前發病率和死亡率居首位的惡性腫瘤，是癌癥死亡的主要原因之一，其中非小細胞肺癌（non?smallcell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的85%，在NSCLC中，主要的類型為腺癌（ade?nocarcinoma，AC）、鱗狀細胞癌（squamouscell carci?noma，SqCC）。晚期NSCLC患者的預后極差，5年生存率＜15%［1］。近年來肺癌分子驅動基因的檢測越來越受到關注，尤其是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶結構域突變、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lym?phoma kinase，ALK）易位以及KRAS突變等基因的檢測。而ROS1基因易位是新近發現的NSCLC另一驅動基因［2］，ROS1易位是NSCLC中獨立的分子亞型，在NSCLC中的發生率約為1%～2%［3］，在EGFR與ALK雙陰性肺腺癌患者中的陽性比例更高［4］。前期臨床研究顯示，ALK酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼（Crizotinib）對ROS1易位的NSCLC有較好的活性［5］。檢測ROS1基因易位的方法有免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase poly?merase chain reaction，RT?PCR）和二代測序技術（next generation sequencing，NGS）。

目前國內對ROS1研究的報道中，綜述較多，大宗的臨床病例及靶向治療方面的報道較少。因此，本研究采用FISH技術檢測613例肺癌ROS1基因易位，總結易位陽性病例臨床病理特點并探討FISH技術在ROS1基因易位檢測中的價值。

1 材料與方法

1.1 病例收集

2014年1月至2016年1月間四川大學華西醫院病理科完成ROS1基因FISH檢測的613例石蠟組織標本。記錄所有患者的臨床資料包括：性別、年齡、吸煙史、臨床分期、治療及隨訪情況。組織病理分型和臨床分期參考2015版世界衛生組織的肺癌組織學分類［6］。

1.2 實驗方法

1.2.1 IHC檢測及評分標準

所有標本均為10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm。ROS1 IHC采用手工方法。ROS1抗體（D4D6）購自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，美國），并按1∶100稀釋。用pH=9.0的EDTA抗原修復液，修復條件為97℃，40 min。一抗孵育過夜，于一抗之后使用增強劑（Dako，美國），室溫孵育10 min，并用增強顯色試劑盒檢測。ALK IHC采用VentanaBench?Mark XT全自動染色。

ROS1 IHC結果判讀標準：0+（陰性）：腫瘤細胞無明確著色；1+：＞5%腫瘤細胞呈現微弱或模糊的胞漿著色；2+：＞5%腫瘤細胞中等強度胞漿著色；3+：＞5%腫瘤細胞胞漿強陽性著色［6］。ALK IHC結果判讀采用試劑盒推薦的二元化標準，即：在空白對照及陽性對照均正常的情況下，檢測樣本評價為陽性或者陰性。

1.2.2 FISH檢測及判讀標準

采用ROS1雙色分離探針（Vysis LSI ROS1 Du?al Color，Break Apart Rearrangement Probe，Abbott Molecular），將613例肺癌患者病理組織樣本石蠟切片按照常規FISH實驗步驟進行處理。雜交過程嚴格按照ROS1探針試劑盒說明書操作。

FISH結果判定：在熒光顯微鏡下觀察結果，正常ROS1基因呈現紅綠重合的黃色信號，當紅綠信號分開且兩信號之間距離大于2個信號點大小或出現單獨的綠色信號時判定為該細胞ROS1易位基因陽性［8］。選擇染色明亮、細胞核完整且雜交信號強的腫瘤細胞進行計數，至少計數50個腫瘤細胞，閾值設定為15%。

1.2.3 EGFR突變PCR檢測

采用DNeasy試劑盒（Qiagen，德國）提取石蠟包埋組織中DNA。EGFR突變采用ARMS法檢測29位點突變（AmoyDx，艾德，中國廈門）。

1.3 統計學分析

研究數據采用SPSS 19.0進行分析處理。組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ROS1易位患者臨床病理特征

613例肺癌患者平均發病年齡為58.47歲，中位年齡59歲（20～94歲）。男：女=1.30∶1。613例肺癌患者中共檢出19例ROS1基因易位，陽性率為3.1%，均為肺腺癌。陽性患者年齡略輕（平均56.1歲），與陰性組差異無統計學意義（P＞0.05）。陽性患者中男性8例，女性11例，男∶女=0.73∶1，女性患者更多見（P＞0.05）。19例中6人有吸煙史，13例無吸煙史（P＞0.05）。陽性病例臨床分期多為晚期，其中Ⅲ期8例、Ⅳ期9例，組織學亞型以實體與腺泡型為主（圖1）。其分化程度為：低分化13例（68%）、低～中分化5例（26%）、中分化1例（5%），無高分化病例。ROS1易位患者臨床病理特征見表1。

表1 ROS1陽性患者臨床病理特征（n=19）Table 1 The major clinicopathological features for ROS1 positive cases（n=19）

2.2 ROS1易位患者IHC及分子檢測結果

19例陽性病例ROS1蛋白表達為：1例（5%）0+，2例（11%）1+，7例（37%）2+，9例（47%）3+。ROS1易位病例陽性細胞平均比例為60%，范圍為35%～78%。其中12例（63.16%）為經典紅綠分離，7例（36.84%）為單獨綠色（圖2）。ROS1易位病例ALK Ventana染色均為陰性，1例同時具EGFR 19外顯子突變，余18例均為EGFR野生型。

2.3 治療情況

19例易位病例全部獲得隨訪，截止到2016年6月，有3例病人死亡。1例為44歲女性患者（生存時間17個月），形態為微乳頭狀；1例為25歲女性患者（生存時間1個月），形態為實體和腺泡結構為主；另1例為20歲男性患者（生存時間3個月），形態為實體性。此3位病人平均生存時間為7個月。有7例患者行克唑替尼靶向治療，一日兩次，每次口服劑量250 mg。治療時間為1～14個月，平均治療時間為8.3個月。7例患者均無疾病進展。1例生物治療；1例未行治療。其中部分病人同時行放化療。

圖1 ROS1陽性病例形態學特點Figrue 1 Histologic features of ROS1 positive cases

圖2 熒光原位雜交檢測ROS1易位信號模式（×1 000倍）Figure 2 The ROS1 translocation signals by FISH（×1 000）

3 討論

肺癌因其高發病率及死亡率成為研究的熱點，其分子靶向治療也引起極大的關注。ROS1易位NSCLC為NSCLC中一個獨特的分子亞型。ROS1基因定位于6號染色體，屬于受體酪氨酸激酶家族，迄今已發現至少9種ROS1易位基因。本研究采用FISH法檢測613例肺癌患者ROS1基因，共檢出19例陽性病例，陽性率3.1%，比文獻報道NSCLC中ROS1易位整體1%～2%的陽性率略高［8］，可能與本研究的部分病例為EGFR和ALK基因雙陰性有關，從而間接提高了ROS1的檢出率。本研究與武莎菲等［9］報道的EGRF/KRAS/ALK三陰肺癌患者中ROS1易位3.7%的陽性率接近。ROS1易位陽性患者與陰性患者相比，年齡較小、女性非吸煙患者稍多、分化程度低、臨床分期高，與文獻報道相符［10?11］。組織學類型集中在實體、腺泡和乳頭狀亞型，并伴有印戒細胞、粘液、篩狀、貼壁等成分。同一病例各不同組織學亞型之間ROS1基因結果無差異，ROS1基因表達無異質性。國內程弘夏［12］與劉盡國［13］分別報道了53例和16例ROS1易位病例，均發現ROS1易位在青年、非吸煙患者中較為多見。

研究認為NSCLC中驅動基因改變是相互排斥的。本研究檢測到1例無吸煙史的女性患者存在ROS1易位與EGFR 19外顯子突變。此病例ROS1 IHC 1+，ROS1 FISH檢測為經典紅綠分離信號。組織學類型以實體和腺泡為主，未行克唑替尼靶向治療，截止隨訪，仍存活。目前有一些文獻陸續報道ROS1易位與EGFR突變共存的現象。Rimkunas等［1］報道9例ROS1重排患者中，有2例患者同時存在EGFR不同位點突變。劉盡國等［13］通過PCR方法從369例肺腺癌組織中檢測到3例ROS1易位與EGFR突變共存病例。說明ROS1易位可與EGFR突變共存，但ROS1易位本身陽性率低，ROS1易位與EGFR突變共存的病例更少。目前關于這類雙陽性病例的臨床病理及治療情況有限，有待進一步研究。

ROS1與ALK受體酪氨酸激酶（receptor tyro?sine kinase，RTK）結構域有49%的氨基酸同源序列。多種ALK抑制劑在體外均可抑制ROS1的活性。ALK抑制劑克唑替尼通過抑制ROS1的磷酸化從而抑制ROS1的激酶活性。在本組ROS1陽性病例中，采用IHC檢測ALK蛋白的表達，19例病例全部為陰性，未檢測到ROS1與ALK雙陽病例。ALK基因易位發生率在3%～7%。在我國間變性淋巴瘤激酶（ALK）陽性非小細胞肺癌診斷專家共識中［14］，ALK?Ventana、ALK?FISH和ALK?PCR 3種檢測ALK易位的方法都得到了認可。全自動ALK免疫組織化學（Ventana IHC）與Vysis ALK雙色分離探針檢測間的符合率在97%，Ven?tana IHC的特異性能達到100%，敏感性也在95%以上［15］。

本研究中7例ROS1易位患者行克唑替尼靶向治療，治療時間為1～14個月，平均治療時間為8.3個月，均無疾病進展。2014年新英格蘭雜志報道50例ROS1陽性NSCLC患者行克唑替尼靶向治療，其療效優于ALK易位患者［16］。因此如何準確有效地篩選出ROS1易位肺腺癌患者，讓更多的患者從靶向治療中獲益就顯得尤為重要。

檢測ROS1基因易位有多種方法［17］，包括FISH、PCR、IHC和二代測序技術。PCR技術對樣本RNA質量要求較高，且不能檢測未知的斷裂點。有研究認為IHC快速、簡便且價格低廉，可用于初步篩查ROS1基因易位［18］。但在ROS1易位基因的IHC檢測中，暫無統一的實驗流程及判讀標準，也未實行自動化操作。本研究中，1例ROS1易位FISH陽性病例其ROS1 IHC結果為陰性。此病例為胸水細胞塊，可能與腫瘤細胞在保存、運輸過程中樣本質量或抗原丟失有關，提示IHC染色可能會出現少數病例漏診的現象。近年NGS研究較多，而臨床應用較少。本研究中FISH檢測在各種類型的石蠟包埋組織樣本中均取得成功，易位信號明確，易于判讀。

本研究通過FISH技術檢測613例肺癌石蠟包埋組織中ROS1基因易位，檢出19例陽性病例，陽性率為3.1%。ROS1易位作為NSCLC中獨立的分子亞型，其更易發生在年輕、女性、不吸煙的腺癌患者中。組織學類型以實體和腺泡狀成分為主。ROS1易位可與EGFR突變共存，本研究未檢測到ROS1易位與ALK易位共存病例。FISH方法可有效的檢測肺癌ROS1基因易位。與IHC相比，FISH檢測ROS1基因易位特異性更高，從而為患者靶向治療提供可靠的依據。

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Detection of ROS1 gene rearrangement by FISH in lung cancer and analysis of its clinicopathological features

CHEN Min,LIU Xiaoyu,LV Lixia,YANG Jieliang,WANG Weiya★
(Department of Pathology,West China Hospital of Sichuan University,Chengdu,Sichuan,China,610041)

ObjectiveTo analyze the molecular,pathological,and therapeutic features of ROS1?translocation positive lung cancer cases,and to investigate the value of fluorescence in situ hybridization(FISH) in screening for and confirming the ROS1 translocation.MethodsIn this study,ROS1?translocation detection was performed in 613 cases with FISH.For ROS1?FISH positive samples,manual ROS1 immunohistochemistry (IHC),ALK IHC using a Ventana auto?stainer and EGFR mutation status were analyzed.Results19 ROS1?translocation positive cases were detected by FISH and with a positive incidence of 3.1%.The average percentage of positive tumor cells was 60%,ranging from 35%to 78%.Among these positive cases,63.2%(12/ 19)cases displayed classical break apart signals,whereas 36.8%(7/19)showed isolated green signals.In the ROS1?translocation group,the expression of ROS1 protein are as follows:1 case was not stained 0+（5%）;2 cases had weak expression 1+(11%);7 cases had moderate expression 2+(37%)and 9 cases had strong expression 3+(47%).With the exception of one patient with an EGFR deletion mutation in exon19,ROS1?translocation positive adenocarcinomas in all patients revealed no alterations in ALK or EGFR genes.The ROS1?translocationpositive patients were slightly younger than the negative patients,and were predominantly female, non?smokers.Most of the ROS1?translocation tumors showed solid,acinar and papillary patterns with a moreadvanced clinical stage.Furthermore,the positive cases all survived except 3 patients,and 7 patients were treated with crizotinib.ConclusionROS1 rearrangement tends to occur in younger,female,non?smoking lung adenocarcinoma patients.To make a definite positive diagnosis of ROS1?translocationin lung cancer,FISH is a relevant detection method.

Non?small cell lung cancer(NSCLC);ROS1 translocation;Fluorescence in situ hybridization(FISH)

國家自然科學基金（81302027）

四川大學華西醫院病理科，四川，成都 610041

★通訊作者：王威亞，E?mail：151422303@qq.com