原發性肝癌表皮生長因子受體突變的研究

于淼 邱李輝 熊偉 蘇慧娟 葉綠

原發性肝癌表皮生長因子受體突變的研究

于淼1邱李輝1熊偉1蘇慧娟1葉綠2★

目的對原發性肝癌患者EGFR基因進行檢測，分析EGFR基因突變與原發性肝癌及患者年齡組成的關系。方法對2507例確診原發性肝癌的石蠟包埋組織樣本用PCR擴增法和雙向測序法檢測EGFR基因突變狀態。結果2507例患者僅檢測出620例（24.74%）EGFR基因20外顯子同義突變Q787Q（2361G＞A）和263例（10.49%）19內含子點突變（2284?60T＞C）；EGFR基因突變與患者性別、病理類型無關（P＞0.05），與患者的年齡段組成明顯相關（P＜0.05），且基于年齡段的分布，20外顯子突變與19內含子突變呈顯著正相關（P＜0.05）。結論本研究中未發現EGFR基因熱點突變。同義突變位點Q787Q尚存在進一步需要被證實的功能。20外顯子突變和19內含子突變與患者年齡分布有明顯相關性，可為原發性肝癌患者提供更具體的個體化治療方案。

原發性肝癌；表皮生長因子受體；基因突變

原發性肝癌（primary hepatocarcinoma，PHC）是指源于肝細胞和肝內膽管上皮細胞的惡性腫瘤，包括膽管囊腺癌、肝細胞?膽管細胞混合癌及一些少見類型，其中常見類型為肝細胞癌和肝內膽管癌，是我國最常見的惡性腫瘤之一。最新統計結果顯示，我國肝癌新增病例占全世界總數的50.5%，死亡病例占全世界總數的51.3%［1］。原發性肝癌是一種多條染色體上多個基因變化的復合基因病，基因改變的累加效應直接促成了肝癌的發生［2］。其中許多關鍵基因（ras、p53、BRCA2等）的突變、缺失或過表達均與肝癌的發生高度相關［3］。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor re?cepter，EGFR）是一種受體型酪氨酸激酶，是相對分子質量為170×103的跨膜糖蛋白［4］。研究表明，在多種惡性腫瘤中均檢測到EGFR過度表達或突變，如非小型細胞肺癌、頭頸部癌、卵巢癌、宮頸癌、食管癌等［5?8］。近年來研究表明，肝癌中EGF及EGFR也存在過度表達或突變，這可能與肝癌的形成、侵襲性生長、臨床特征有密切關聯，并且在低分化的肝癌患者中，EGFR過表達影響到患者預后的恢復［9?11］。我國有學者認為EGFR和EGFRvIII高表達可能是肝細胞癌變的重要因素，可以作為評價肝癌轉移、復發的參考指標［12?14］；但是有關EGFR與我國原發性肝癌人群關系的研究國內鮮有報道，且不全面。本研究擬對2 507例原發性肝癌患者EGFR基因的突變情況進行檢測，初步分析EGFR基因突變情況與患者臨床特征之間的關系，并探討EGFR基因突變與患者年齡組成的關系，為原發性肝癌的分子靶向治療提供基礎性參考依據和臨床指導，希望找到一條原發性肝癌分子靶向治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013年3月至2014年7月來自全國各醫院病理科經手術切除的原發性肝癌石蠟包埋組織樣本2 507例，顯微鏡下證實腫瘤細胞完整。其中男性2 153例，女性354例；年齡19～87歲，中位年齡52歲；病理類型：2 307例肝細胞癌，179例肝內膽管癌，21例肝膽混合癌。病理學分類按照WHO標準［1］。所有患者手術前均未接受過放療化療及靶向藥物治療。樣本均在RNAlater（QIAGEN，德國）的凍存管中4℃保存，并于2個工作日內送達實驗室進行檢測。

1.2 提取基因組DNA

應用石蠟切片DNA提取試劑盒（FFPE gDNA miniPREP KIT，BIOMIGA，美國）進行DNA提取。用瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，經紫外分光光度法測定濃度與純度并稀釋，要求A260/A280大于1.8且小于2.0，原液濃度為200 ng/μL，置于?20℃冰箱中保存?；蚪MDNA工作液稀釋至濃度60 ng/ μL，置于4℃保存。

1.3 聚合酶鏈反應PCR擴增和基因測序

采用PCR擴增法和測序法分析原發性肝癌患者石蠟包埋組織中EGFR基因突變情況。根據NCBI發布的EGFR全基因組序列（NM?005228）和mRNA序列，用Oligo軟件在EGFR第18、19、20、21外顯子兩側各設計1對PCR引物。序列如下：

第18外顯子：上游引物：5′?CAGGTGATTCGTG?GAGCCC?3′，

下游引物：5′?TAGGATGTGGAGATGAGCAG?3′。第19外顯子：上游引物：5′?ACTTCACAGCCCT?GCGTAAAC?3′，

下游引物：5′?ATGGGACAGGCACTGATTTGT?3′。第20外顯子：上游引物：5′?CAGCAGCGGGTTA?CATCTTC?3′，

下游引物：5′?GCAGCCTGCTCCCTGGTGTC?3′。

第21外顯子：上游引物：5′?GCTTGGTGCACCGC?GACCTG?3′，

下游引物：5′?CGCACCCAGCAGTTTGGCGA?3′。

PCR反應體系組成為：水33 μL，10×PCR buf?fer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，60 ng/μL DNA模板4 μL，反應總體積為50 μL。反應條件均為94℃預變性5 min；94℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共50個循環；72℃延伸5 min，4℃保溫。所有產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測，純化后的產物從正反雙鏈測序分析EGFR基因突變情況。測序儀器為ABI PRISM3730（USA），測序結果用Chromas軟件進行分析。

1.4 統計分析

采用SPSS 21.0和ORIGION 8.0軟件進行數據處理和分析，應用列聯表卡方檢驗分析EGFR基因突變與患者性別、年齡和病理類型之間的關系，必要時用Fisher’s精確概率法分析，當P＜0.05認為差異顯著；根據不同年齡組成與EGFR基因突變率的分布散點圖，應用回歸分析求出其擬合曲線，并建立回歸方程。

2 結果

2.1 EGFR基因突變情況

EGFR基因的突變特點及類型見表1。2 507例患者EGFR基因18、19、21外顯子未檢測到任何突變或缺失；檢測出620例（24.74%）20外顯子突變，突變類型為同義突變Q787Q（2361G＞A）；263例（10.49%）檢測到19內含子點突變（2284?60T＞C）；發生19內含子突變的患者同時發生20外顯子的突變，即雙突變（10.49%）。測序結果見圖1。

表1 EGFR基因突變的分布特點及類型Table 1 The type and distribution of EGFR gene mutation

表2 EGFR基因突變與臨床特征的關系Table 2 Correlation of EGFR mutation to clinical characteristics of PHC

2.2 EGFR基因突變與患者臨床特征之間的關系

EGFR基因突變與患者臨床特征之間的關系見表2。由表2可見，在2 507例病例中，男性患者2 153例，EGFR基因突變率為24.66%，女性患者254例，EGFR基因突變率為 25.14%；576例（24.97%）肝細胞癌、42例（23.46%）肝內膽管癌和2例（9.52%）肝膽混合癌發生EGFR基因突變。EGFR基因的突變與性別、病理類型均不具有統計學意義（P＞0.05）。

2.3 EGFR基因突變例數與肝細胞癌患者年齡組成的關系

EGFR基因的突變例數與肝細胞癌患者年齡組成之間的關系如圖2示。EGFR基因突變例數與肝細胞癌患者年齡段呈拋物線關系，年齡50～59歲的患者突變數量最多，方差檢驗有顯著相關。回歸分析顯示：回歸系數R=0.958，決定系數R2=0.918，校正決定系數R2=0.917，顯著性檢驗P＜0.000 1，回歸方程：y=-840.413+38.883x-0.363x2（y為20外顯子突變率，x為肝細胞癌患者平均年齡）。

2.4 EGFR基因20外顯子和19內含子突變率與肝細胞癌患者年齡組成之間的關系

圖1 EGFR基因突變的測序結果Figure 1 Sequencing results of mutations in the EGFR gene

圖2 EGFR基因突變例數與肝細胞癌患者年齡之間的關系Figure 2 Correlation of number of EGFR mutation to age groups of patients of PHC

圖3 EGFR基因的突變情況與肝細胞癌患者年齡組成之間的關系Figure 3 Correlation of EGFR mutation to age groups of patients of PHC

EGFR基因的突變情況與肝細胞癌患者年齡組成之間的關系如圖3和表3示。第20外顯子突變率與突變患者年齡段呈拋物線關系，年齡50～59歲的突變患者比例最高，方差檢驗有顯著相關。回歸分析顯示：回歸系數R=0.958，決定系數R2=0.918，校正決定系數R2=0.916，顯著性檢驗P＜0.000 1，回歸方程：y=-135.507+6.27x-0.059x2（y為20外顯子突變率，x為突變患者平均年齡）；19內含子突變率與突變患者年齡段也呈拋物線關系，年齡50～59歲的突變患者比例同樣也最高，方差檢驗有顯著相關?；貧w分析顯示：回歸系數R= 0.917，決定系數 R2=0.841，校正決定系數 R2= 0.838，顯著性檢驗 P＜0.000 1，回歸方程：y=-147.435+6.75x-0.063x2（y為19內含子突變率，x為突變患者平均年齡）。進一步分析顯示，基于突變患者年齡段分布，EGFR基因20外顯子突變率與19內含子突變率呈顯著正相關（P＜0.01）。

2.5 EGFR基因突變與患者病理類型的關系

EGFR基因突變與病理類型的關系見表4。由表4可見，在2 307例肝細胞癌病例中，男性為500例（24.95%），女性為76例（25.08%）；在179例肝內膽管癌和21例肝膽混合癌病例中，男性分別為32例（23.70%）、2例（9.52%），女性分別為10例（22.73%）、0例發生發生EGFR基因突變。EGFR基因的突變與不同的病理類型均不具有統計學意義（P＞0.05）。

表3 EGFR基因20外顯子突變與19內含子突變的相關系數Table 3 Correlation coefficient between mutants of exon 20 and intron 19 of EGFR

表4 EGFR基因突變與病理類型的關系Table 4 Correlation of EGFR mutation to clinical characteristics of PHC

3 討論

伴隨著慢性肝炎、肝硬化、肥胖發生率及飲食習慣不科學等現象的發生日趨常態，近年來原發性肝癌的發病率逐年升高。由于其分子發病機制具有復雜性、異質性、累積性等特點［2］，并且不同的致癌機制在PHC中均發生不同程度的改變，這為PHC分子靶向治療提出了嚴峻的考驗［15］。目前應用在臨床上的肝癌分子靶向治療中較為成熟有效的也僅限于針對VEGFR2等靶標使用的索拉非尼藥物，并沒有像其他癌癥（肺癌、乳腺癌等）那樣出現跨越式的進步。關于EGFR基因突變情況在肝癌中的分子作用機制尚不明確，且與原發性肝癌關系的報道也極其有限，更多的研究聚焦在肝癌中EGFR基因的表達水平?？梢姡M一步探究肝癌發生的分子機制，為肝癌的分子靶向治療及個體化用藥方案制定建立臨床基礎。

EGFR基因共28個外顯子，其中第18～21外顯子是編碼酪氨酸激酶的區域，EGFR基因發生最常見的突變是第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點突變，被認為是激活突變［5］。以往大量的臨床研究表明，選用EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療發生該活化突變的患者敏感性增強，生存率顯著提高，而未發生突變的患者多數不會從EGFR靶向治療藥物中獲益。本研究結果表明，2 507例患者中未出現EGFR基因的熱點突變，僅檢測到620例（24.74%）第20外顯子發生同義突變Q787Q（2361G＞A），國外學者在原發性肝癌EGFR基因突變的研究中也得出相似的結果［16?17］。

本研究雖未發現EGFR基因上存在熱點突變，但我們發現高比例的20外顯子同義突變Q787Q（rs1050171）。關于Q787Q位點突變的報道屢見不鮮，大量的臨床實驗結果表明，56%宮頸腺癌中EGFR基因外顯子20存在同義突變（Q787Q）［18］，在頭頸鱗狀細胞癌中Q787Q突變率為56.3%［19］。盡管同義突變并未引起氨基酸的改變，但“沉默突變”仍可能通過改變EGFR基因的拼接、mRNA的穩定性，一定程度地影響蛋白質的最終表達。已有研究顯示，EGFR基因2073位點的同義突變導致了EGFR基因轉錄的mRNA縮短，致使EGFR三維結構發生改變［20］；Q508Q同義突變引起TGFBR2基因異常拼接，導致蛋白編碼提前終止［21］。Tagauchi等［19］研究結果表明，含有Q787Q突變型頭頸部癌細胞系較野生型癌細胞系對吉非替尼更為敏感（P＜0.05），預示該位點可能是頭頸部鱗狀細胞癌分子靶向治療的一個潛在靶點。在非小細胞肺癌的研究發現，針對Q787Q突變的患者進行吉非替尼治療后，13%的患者病情獲得明顯緩解［22］。由此可見，同義突變位點Q787Q尚存在進一步需要被證實的功能，這種功能可能會豐富原發性肝癌的靶向治療及發生機制的研究。

值得一提的是，我們通過回歸分析發現，EGFR基因突變率與肝細胞癌患者的年齡段組成明顯相關（P＜0.05）。50～59歲年齡段的患者EGFR基因20外顯子和19內含子突變率均最高。肝內膽管癌和肝膽混合癌病例因數量少，無法按照年齡段組成進行統計學分析。鑒于此，依據EGFR基因突變規律為原發性肝癌患者提供更具體的個體化治療方案。進一步分析發現，攜帶2284?60T＞C突變的患者100%發生2361G＞A突變，而攜帶 2361G＞A突變的患者中僅有約 50%發生2284?60T＞C突變。2284?60T＞C與2361G＞A的關聯及原發性肝癌EGFR基因發生雙突變后相關的生物學事件，將是我們今后深入研究的新方向。

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Analysis of EGFR mutation status in primary hepatocarcinoma patients

YU Miao1,QIU Lihui1,XIONG Wei1,SU Huijuan1,YE Lv2★
(1.Shanghai DaAn Center for Medical Laboratory,Shanghai,China,200120;2.GuangZhou DaAn Clinical Lab?oratory Center Pathology Department,Guangzhou,Guangdong,China,510080)

ObjectiveTo detect the EGFR mutations(exon18,19,20,21)in primary hepatocarcino?ma(PHC)tissue,and to study the correlation between the EGFR mutations and the ages and clinical features of the patients with the aim of supporting the development of new molecular targeting therapy for PHC patients.MethodsParaffin embedded tissues from 2 507 cases were collected,and EGFR mutations were detected us?ing PCR and bidirectional sequencing.ResultsOut of the 2 507 cases of PHC,there were 620 PHC pa?tients carrying a silent mutation,which showed a G?to?A transition at nucleotide 2361 in exon 20 of the gene. Furthermore,263 PHC patients(10.49%)were found to be carrying the mutation 2284?60T＞C in intron 19 The EGFR mutations 2361G＞C and 2284?60 were not related to sex or pathology(P＞0.05),but were related to the age of the PHC patients(P＜0.05).In addition,a significant positive correlation was found between the mutation rate of exon 20 and intron 19(P＜0.05)based on the ages of the PHC patients.ConclusionThere were no hot mutations found in the EGFR gene.The features of the EGFR 2361G＞C mutation need to be analyzed fur?ther.Investigation into the characteristics of exon 20 and intron 19 may provide avenues for more individualized therapy in PHC.

Primary hepatocarcinoma(PHC);Epidermal growth factor recepter(EGFR);Gene muta?tion

1.上海達安醫學檢驗所有限公司，上海200120 2.廣州達安臨床檢驗中心病理事業部，廣東，廣州510080

★通訊作者：葉綠，E?mail：yelv@yunkanghealth.com