基因芯片技術對結核分枝桿菌耐藥性檢測的臨床應用

陳瑤 吳英松

基因芯片技術對結核分枝桿菌耐藥性檢測的臨床應用

陳瑤 吳英松★

目的評價基因芯片技術對結核分枝桿菌耐藥性檢測的效果。方法選取我院結核科2014年3月至2016年3月收治的涂片陽性的肺結核住院患者238例，取其痰標本，分別用基因芯片、傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗3種方法進行結核分枝桿菌的異煙肼耐藥性檢測和利福平耐藥性檢測；把羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗的結果作為金標準，評價基因芯片技術的臨床應用價值。結果基因芯片技術檢測涂片陽性患者痰標本異煙肼耐藥的情況與金標準無顯著差異（P＞0.05）；利福平耐藥的情況與金標準相比也無明顯差異（P＞0.05）。結論基因芯片能夠快速、準確地檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥情況，是一種值得推廣的臨床實驗室檢測方法。

基因芯片技術；結核分枝桿菌；耐藥性；檢測

結核作為一種慢性傳染病，在我國每年因結核病死亡的患者多達13萬［1］。由于耐藥的結核分枝桿菌增加［2］，預計將來結核病的流行態(tài)勢可能會以耐藥菌為主；因此，耐藥結核病的防治將會成為一項重要課題。臨床上，傳統(tǒng)的實驗室檢測方法有細菌培養(yǎng)、抗酸染色等，但是這些方法存在耗時較長、假陽性高和靈敏度低等問題［3］。基因芯片技術是近年來開展的分子生物學檢測技術，時效性較傳統(tǒng)方法要高［4］。目前，對結核分枝桿菌的檢測，多以分離菌株為檢測對象；以痰標本為檢測對象的報道少見。從結核防治的實際出發(fā)，本研究以痰標本為檢測對象，以傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗作為診斷的金標準，評估基因芯片技術對結核分枝桿菌的異煙肼和利福平耐藥性的檢測效果；為評價這項技術在臨床上的應用提供實驗依據。

1 研究對象和方法

1.1 一般資料

選擇我院結核科2014年3月至2016年3月收治的涂片陽性肺結核住院患者238例作為研究對象。其中男128例，女110例，年齡21～65歲，平均年齡45.6±6.7歲。

1.2 采集患者的痰標本

每例患者留取清晨第一口痰標本，每人3份，每份5 mL；經檢測后，留取涂片陽性級別較高（2+以上）的2份，各取1 ml混勻，進行基因芯片檢測；剩下的痰標本做羅氏培養(yǎng)。

涂片陽性級別的判斷方法：①陰性：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現抗酸桿菌；②可疑陽性：1～8條抗酸桿菌/300視野；③1+：3～9條抗酸桿菌/100視野；④2＋：1～9條抗酸桿菌/10視野；⑤3＋：1～9條抗酸桿菌/每視野；⑥4＋：≥10條抗酸桿菌/每視野。

1.3 基因芯片技術

整個檢測過程大約24 h，具體流程如下：

1.3.1 樣品制備

向盛有痰液的無菌盒加入4%氫氧化鈉10 mL，對收集到的痰標本進行預處理；隨后進行細菌核酸提取；進行基因擴增。PCR擴增儀由博奧生物有限公司提供。

每管PCR反應體系總體積為20 μL，其中Mtb分離株DNA模板為2 μL，PCR擴增試劑1、PCR擴增試劑2和PCR擴增試劑3各18 μL。PCR產物1為對照產物，與兩種微陣列都進行雜交。PCR產物2為rpoB基因的擴增產物，與利福平微陣列相對應；PCR產物3為katG基因及inhA基因啟動子的擴增產物，與異煙肼微陣列相對應。PCR擴增程序為：37℃600 s，94℃600 s；94℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，35個循環(huán)；然后94℃30 s，72℃60 s，10個循環(huán)；最后置72℃420 s。

1.3.2 芯片反應

PCR擴增完畢，完成變性后，將產物加入Mtb耐藥性檢測試劑盒（北京百奧瑞生物技術有限公司提供）的芯片點陣中，完成芯片雜交反應，并洗去非特異性雜交的核酸片段。

取雜交緩沖液9 μL，分別加入同一樣品的PCR產物1和PCR產物2各3 μL，或者加入PCR產物1和PCR產物3各3 μL。置于PCR擴增儀中于95℃變性5 min，然后冰浴3 min；將13.5 μL雜交反應混合物經蓋片的加樣孔加入，迅速蓋上雜交盒并密封；放入50℃預熱的恒溫水浴鍋中120 min；水平取出雜交盒，拆開取出芯片，洗滌后離心甩干。

1.3.3 結果判讀

甩干后，將芯片載入LuxScan 10KB微陣列芯片掃描儀（博奧生物有限公司提供），判讀檢測結果。

1.4 傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗

以傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)和藥敏試驗作為金標準，對238例患者的痰標本進行羅氏培養(yǎng)，陽性的痰標本做藥物敏感性試驗。整個過程大約2～3個月。

1.4.1 羅氏培養(yǎng)

在預處理之前，將痰標本接種到酸性改良的羅氏培養(yǎng)基上，觀察菌落的生物學特點。羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術有限公司生產，規(guī)格為7 mL/支。

1.4.2 藥敏試驗

觀察結核桿菌的菌落，取菌落接種，配制菌懸液（1 mg/mL），稀釋濃度至10?2mg/mL和10?4mg/ mL，分別接種到含異煙肼（0.2 μg/mL）和利福平（40 μg/mL）的藥敏培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)6周，觀察培養(yǎng)結果。

1.5 數據統(tǒng)計

所有的數據采用SPSS19.0處理。計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；真實性采用靈敏度和特異度評估；可靠性用Kappa值評估，Kappa值為0.41～0.6為中度一致性，0.61～0.8為高度一致性，0.8～1.0為最強一致性。

2 結果

2.1 檢測的一般情況

238例患者的痰標本中，培養(yǎng)結果陰性15例，剩余的痰標本中，非結核分枝桿菌感染5例，耐藥檢測結果不完整者14例，最終納入分析的患者為204例。初治涂片陽性155例，復治涂片陽性49例。

2.2 異煙肼耐藥性檢測結果

2.2.1 初治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結果

檢測結果，異煙肼耐藥24例，17例為katG基因突變，7例為inhA基因突變。結果顯示，與金標準相比無顯著差異（P＞0.05）；對于初治涂片陽性的患者，采用基因芯片技術，靈敏度是86.67%，特異度是92.14%；kappa值為0.81，一致性為高度（表1）。

表1 初治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結果Table 1 The Results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of isoniazid resistance in patients with smear positive at the first treatment

2.2.2 復治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結果

檢測結果，異煙肼耐藥13例，9例為katG基因突變，4例為inhA基因突變。結果顯示，與金標準無顯著差異（P＞0.05）；對于復治涂片陽性的患者，采用基因芯片，靈敏度是90.91%，特異度是92.11%；kappa值為0.83，一致性為最強（表2）。

表2 復治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的結果Table 2 The results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of Isoniazid resistance in patients with smear positive in the second treatment

2.3 利福平耐藥性檢測結果

2.3.1 初治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結果

檢測結果，利福平耐藥32例，均為rpoB基因突變。結果顯示，與金標準無顯著差異（P＞0.05）；對于初治涂片陽性的患者，采用基因芯片技術，靈敏度是90.48%，特異度是91.44%；kappa值為0.85，一致性為最強（表3）。

表3 初治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結果Table 3 The results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of rifampicin resistance in patients with smear positive at the first treatment

2.3.2 復治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結果

檢測結果，利福平耐藥15例，均為rpoB基因突變。結果顯示，與金標準無顯著差異（P＞0.05）；對于復治涂片陽性的患者，采用基因芯片技術，靈敏度是81.82%，特異度是84.21%；kappa值為0.790，一致性為高度（表4）。

表4 復治涂片陽性患者痰液結核分枝桿菌基因芯片檢測對利福平耐藥性的結果Table 4 The results of Mycobacterium tuberculosis sputum stain detection of rifampicin resistance in patients with smear positive in the second treatment

3 討論

基因是染色體上具有遺傳效應的DNA片段［5］。基因芯片技術是一項新興的現代分子生物學技術，其原理是對待測的DNA用另一個已知核酸序列的DNA按堿基互補配對的原則雜交，然后通過計算機處理，得到待測DNA的序列［6］。基因芯片技術的靈敏性和特異性都比較高，因此這項技術也逐步成為診斷疾病的尖端技術，對于指導臨床合理、及時、準確地用藥提供了很大的方便。

異煙肼和利福平是最主要的一線抗結核藥［7］，快速檢測結核分枝桿菌對這兩種藥物的敏感性在抗結核治療的過程中十分重要。目前，國內外已經開始運用基因芯片技術對結核分枝桿菌的耐藥性進行檢測［8］，檢測的對象主要是結核分枝桿菌的分離菌株。然而，臨床結核防治過程中，檢測的主要對象是以患者的痰為標本。考慮到這一點，本次研究收集所有患者的痰液后，對結核分枝桿菌的主要突變基因位點進行檢測，如katG、inhA和rpoB等［9］，評價基因芯片技術對異煙肼和利福平耐藥性檢測的真實性與可靠性。

國外研究發(fā)現，與DNA測序相比，采用基因芯片技術，檢測結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性，靈敏度達到84.1%，特異度達到100%；對利福平的耐藥性分別是100%和95.3%［10］。另外，相對于藥敏試驗，檢測對異煙肼耐藥性的靈敏度是88.59%，特異度是91.53%，對利福平耐藥性分別是85.39%和88.45%［11］。本研究的檢測結果顯示：采用基因芯片技術，與藥敏試驗相比，檢測對異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為86.67%～90.91%和92.11%～92.14%；檢測對利福平耐藥性的靈敏度和特異度分別為81.82%～90.48%和84.21%～91.44%。與國外的研究結果比較接近，表明在結核防治工作中，采用基因芯片檢測技術，以痰標本作為檢測對象，檢測結核分枝桿菌的耐藥性，結果是可靠的。

Guo Y等［12］以痰標本為檢測對象，用基因芯片技術檢測異煙肼和利福平耐藥性，同藥敏試驗比較，其一致性分別是80.3%和84.2%。本文的結果顯示，相對于藥敏試驗，基因芯片技術對于異煙肼耐藥檢測結果的Kappa值為0.81～0.83，其一致性為最強；對于利福平耐藥檢測結果的Kappa值為0.79～0.85；其一致性也為最強。這同Guo Y等［12］的研究結果基本一致。上述檢測結果表明，在結核臨床防治工作中，采用基因芯片檢測技術，以痰標本作為檢測對象，檢測結核分枝桿菌的耐藥性，結果可靠。

綜述所述，應用基因芯片技術檢驗結核分枝桿菌對異煙肼和利福平的耐藥性，真實性和可靠性都得到了實驗數據的驗證，在結核病的臨床快速診療領域具有廣闊的應用前景。

［1］World Health Organization.Tuberculosis［J］.Saudi Medical Journal，2013，34（11）：1205?1207.

［2］陳誠，李仁忠，陳明亭，等.全國結核病流行病學抽樣調查及各省耐藥監(jiān)測中耐藥結核病疫情資料分析［J］.疾病監(jiān)測，2013（4）：265?268.

［3］Fan L，Zhang Q，Cheng L，et al.Clinical diagnostic performance of the simultaneous amplification and test?ing methods for detection of the Mycobacterium tuber?culosis complex for smear?negative or sputum?scarce pulmonary tuberculosis in China［J］.Chinese medical journal，2013，127（10）：1863?1867.

［4］湯桂麗.基因芯片技術在臨床微生物檢驗中的應用和優(yōu)勢［J］.中國藥業(yè)，2015，24（5）：92?94.

［5］Brown T A，Brown T.Gene cloning and DNA analy?sis：an introduction［M］.John Wiley&Sons，2016.

［6］云云，汪長中，吳璇.病原微生物檢測技術進展［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（3）：501?503.

［7］Mishra S，Nandwani S，Saluja M，et al.Prevalence of primary resistance against Isoniazid and Rifampicin in newly diagnosed sputum positive cases of pulmonary Koch′s using line probe assay［J］.International Jour?nal of Contemporary Medicine，2014，2（2）：33?36.

［8］Cabibbe A M，Miotto P，Moure R，et al.Lab?on?chip?based platform for fast molecular diagnosis of multi?drug?resistant tuberculosis［J］.Journal of clinical mi?crobiology，2015，53（12）：3876?3880.

［9］Rodwell TC，Valafar F，Douglas J，et al.Predicting extensively drug?resistant Mycobacterium tuberculosis phenotypes with genetic mutations［J］.Journal of clini?cal microbiology，2014，52（3）：781?789.

［10］Kim SY，Park YJ，Song E，et al.Evaluation of the CombiChip Mycobacteria?drug?resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with re?sistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tu?berculosis［J］.Diagnostic microbiology and infectious disease，2006，54（3）：203?210.

［11］Park H，Song EJ，Song ES，et al.Comparison of a con?ventional antimicrobial susceptibility assay to an oligo?nucleotide chip system for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates［J］.Journal of clinical microbiology，2006，44（5）：1619?1624.

［12］Guo Y，Zhou Y，Wang C，et al.Rapid，accurate de?termination of multidrug resistance in M.tuberculosis isolates and sputum using a biochip system［J］.The In?ternational Journal of Tuberculosis and Lung Disease，2009，13（7）：914?920.

Clinical application of gene chip technology in the detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis

CHEN Yao,WU Yingsong★
(School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong, China,510515)

ObjectiveTo evaluate the effect of gene chip technology on the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis.Methods238 patients with smear positive pulmonary tuberculosis admitted to our hospital from March 2014 to March 2016 were selected as the subjects.Three methods were used to detect isoniazid resistance and rifampicin resistance of Mycobacterium tuberculosisin sputum samples:gene chip, traditional Roche culture and a drug sensitivity test.The results of Roche culture and drug sensitivity test were used as the gold standard to evaluate the value of gene chip technology.ResultsThere was no significant difference in the resistance rate of smear positive patients with isoniazid detected with gene chip and the gold standard(P＞0.05).Similarly,there was no significant difference between the rifampin resistance rate determined by gene chip and the gold standard(P＞0.05).ConclusionGene chip technology can rapidly and accurately detect the resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isoniazid,and it is a valuable clinical laboratory diagnostic method.

Gene chip technology;Tuberculosis;Drug resistance;Detection

重大傳染病創(chuàng)新檢測試劑的研制和應用研究（廣州市協同創(chuàng)新重大專項，201400000004?1）

南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail：wg@smu.edu.cn