利用18S rDNA分子方法分析滸苔綠潮過境期間長牡蠣攝食情況的變化*

王先鋒 林承剛 許 強 宋肖躍 張海建 汝少國 楊紅生①

(1. 中國海洋大學 青島 266003; 2. 中國科學院海洋生態與環境科學重點實驗室(中國科學院海洋研究所) 青島 266071;3. 海南大學 海口 570228; 4. 日照市漁業通訊管理站 日照 276800)

濾食性海洋雙殼貝類在近岸大型底棲生物群體中處于優勢地位, 它們通常充當“生態系統工程師”(Joneset al, 1996), 并可以在浮游生產者和底棲生物之間建立重要聯系。雙殼貝類的食物營養級很廣,但對它的了解卻較少。生態學家們曾嘗試研究出它們全部的食物攝取情況, 但他們面臨的最直接挑戰就是它們所攝取的食物過于微小, 還有其隨時空的變化((Lotsy, 1895; Galtsoff, 1964)。通常判斷濾食性貝類的食物成分非常困難, 這是因為傳統的顯微鏡檢測所需的樣本量較大, 同時還存在著較多胃含物碎片難以鑒別的問題(Fukumoriet al, 2008)。早期有關海洋雙殼貝類的食物成分調查表明其食物源中有重要的初級生產者, 例如硅藻和鞭毛藻(Galtsoff, 1964)。大量近期調查研究發現了其食物源也含有次級消費者,例如橈足類, 無脊椎動物幼蟲(Davenportet al, 2000;Lehaneet al, 2006)。了解雙殼貝類的食物組成對于研究海岸帶食物網和生態基礎管理等方面至關重要。尤其對判斷海洋牧場生態系統將會發生怎樣的改變尤其重要(Fukumoriet al, 2008)。

傳統分類學將滸苔劃分為綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、滸苔屬(Enteromorpha),但近年來取消了滸苔屬, 而將原滸苔屬物種合并為石莼屬(Ulva)(Hiraokaet al, 2004), 并認為導致綠潮暴發的優勢藻類以石莼屬為主(Callowet al, 1997; Hiraokaet al, 2004), 因此本研究也將石莼屬和滸苔屬歸為一類。滸苔屬和石莼屬等大型海洋綠藻大量增殖而導致的海洋生態異常現象, 被稱為“綠潮”。綠潮暴發會引發一系列次生災害, 如藻體腐敗散發出難聞氣味污染環境, 藻類堆積沉降會引起缺氧和底質腐敗, 導致生物死亡。位于日照的平島海域是重要的海洋牧場,每年大規模滸苔都在此有規律的暴發, 滸苔的出現對當地漁民的勞動生產造成很大干擾。平島周圍自然生長著大量的牡蠣和貽貝這兩種重要的經濟貝類,其中屬長牡蠣(Ostrea gigasThunberg)分布最廣、數量最多。長牡蠣屬于濾食性貝類, 目前并沒有研究表明滸苔碎屑是否可以作為長牡蠣食物源或對長牡蠣食物源產生影響。滸苔的成熟藻體較大, 高可達1m, 因此無法作為長牡蠣的食物源, 但在海風海浪和滸苔自身衰敗的作用下會產生滸苔絲狀體碎屑, 這些懸浮在水體中的有機物質大小可以為長牡蠣所攝食,并且滸苔的成熟藻體能產生大量的微觀繁殖體, 滸苔微觀繁殖體作為滸苔生長發育的早期形成產物,主要包括孢子、配子、合子這些無細胞壁保護的裸露單細胞, 在適宜的溫鹽等條件下, 微觀繁殖體 遇到合適附著基就會固著, 進而萌發生長成藻絲體, 固著和萌發是滸苔生長發育的必要階段(Chapman, 1986;Fletcheret al, 1992; Santeliceset al, 2002)。而微觀繁殖體的直徑與小型浮游植物相近。考慮到濾食性貝類以水體中浮游生物和有機碎屑等為主要食物(張繼紅,2008), 水體中滸苔絲狀體碎屑和微觀繁殖體增加,貝類的食物來源可能發生變化。本研究通過高通量DNA測序技術研究了長牡蠣的真核食物成分, 從長牡蠣的攝食狀況角度為預測相關生態風險提供理論依據與數據支持。

1　材料與方法

1.1　樣品收集

圖1　采樣站位區域分布圖Fig.1 Map of sampling site

1.2　長牡蠣殼高測量

采集長牡蠣后用尺子量取其背腹緣最大距離并記錄。

1.3　浮游生物采集

在長牡蠣樣品收集區域附近設置3個采集點, 使用浮游植物網和浮游動物網垂直采集浮游生物, 其中浮游植物網網徑為76μm, 口徑為37cm, 浮游動物網網徑為 500μm, 口徑為 50cm。采集的浮游生物樣品加入甲醛固定帶回實驗室等待檢測。

1.4　胃含物樣品

所有采集的長牡蠣都現場解剖, 提取消化道部分, 轉移至1.5mL凍存管中并做標號, 將凍存管投于液氮罐中帶回實驗室等待進一步處理。

1.5　基因組DNA提取

采用CTAB方法對樣本的基因組DNA 進行提取(Tel-Zuret al, 1999), 之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度, 取適量的樣品于離心管中, 使用無菌水稀釋樣品至1ng/μL。

1.6　PCR擴增

以稀釋后的基因組 DNA為模板, 使用特異引物擴增18S V4區DNA。通常引物序列為528F (5′-GCGG TAATTCCAGCTCCAA-3′)和 706R (5′-AATCCRAGA ATTTCACCTCT-3′) (Cheunget al, 2010)。使用 New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer酶和緩沖液。使用高效和高保真的酶進行 PCR, 能確保擴增效率和準確性(Mago?et al, 2011)。最后設置PCR反應體系和程序 (30μL): Phusion Master Mix(2×) 15μL, Primer(2μmol/L) 3μL (6μmol/L), gDNA (1ng/μL) 10μL(5—10ng), H2O 2μL。反應程序: 98oC 預變性 1min; 30個循環包括(98oC, 10s; 50oC, 30s; 72oC, 30s); 72oC,5min。PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測; 根據 PCR產物濃度進行等質量混樣, 充分混勻后使用 1×TAE濃度 2%的瓊脂糖膠電泳純化 PCR產物, 選擇主帶大小在 400—450bp之間的序列, 割膠回收目標條帶。產物純化試劑盒使用的是 Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒。

1.7　文庫構建和上機測序

使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫的構建, 構建好的文庫經過 Qubit 定量和文庫檢測, 合格后, 使用HiSeq進行上機測序。

1.8　數據分析

測序得到的原始數據(Raw Data), 存在一定比例的干擾數據(Dirty Data), 為了使信息分析的結果更加準確、可靠, 首先對原始數據進行拼接、過濾, 得到有效數據(Clean Data)。

基于有效數據進行OTUs (Operational taxonomic units)聚類和物種分類分析, 根據OTUs聚類結果, 一方面對每個 OTU的代表序列做物種注釋, 得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時, 對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算等分析, 以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有 OTUs信息等(Bokulichet al, 2013;Muelleret al, 2014)。另一方面, 通過PCoA和PCA等降維圖和樣品聚類樹進行展示(Backeljauet al,1996; Zhanget al, 2016)。

3) Overcoupled, τ0>τe, the cavity intrinsic loss is lower than the input power.

2　結果

2.1　殼高

每個月份長牡蠣的殼高是不同的但是都在成年長牡蠣范圍之內, 其殼高平均為49.16mm, 其中最小的45.0mm, 最大的53.1mm。這四個月的長牡蠣可能的年齡結構變化或者長牡蠣的增長率未知。

2.2　浮游生物豐度

浮游植物(表1)和浮游動物(表2)的結果顯示本地浮游動物生物豐度遠低于浮游植物。其中硅藻最多的月份是5月, 甲藻最多的月份為7月。浮游植物各個月的豐度分別是5月55561.7cells/m3, 6月13035cells/m3, 7月81927.7cells/m3, 10月62508cells/m3。浮游動物各個月份的豐度分別為 5月 304.7cells/m3, 6月64.77cells/m3, 7月1638.7cells/m3, 10月140.7cells/m3。

2.3　樣品豐度及多樣性分析

剔除無效樣品和消化道內容物中長牡蠣自身的OTU后總共獲得53347個有效序列片段,每一個樣品中的有效序列片段數量從 2984到10742不等, 平均為4445.58, OTU的數量展示了胃含物中的生物物種豐度情況。

所有樣品中總共獲得105個OTU, 2016年5月(WH1)有57—80個OTU, 6月(WH2)有38—65個OTU,7月(WH3)有 44—56個 OTU, 10月(WH4)有 45—84個OTU。根據OTUs的數目做稀釋曲線和Chao1曲線(圖2a, b)顯示所有樣品都趨向飽和, 如圖顯示, 所有樣品之間的 Shannon多樣性指數差異不顯著(P＞0.05, 圖 2c)。這些結果顯示滸苔發生前和滸苔發生后長牡蠣胃含物的真核生物豐度差異并不顯著,但是胃含物成分不同。

表2　浮游動物豐度(ind/m3)Tab.2 The abundance of zooplankton (ind/m3)

2.4　真核生物成分分析

所有樣品中共鑒定出15個門類, WH1樣品11個門, WH2樣品12個門, WH3樣品11個門, WH4樣品14個門。每組樣品中未鑒別的真核生物比例為5.9%—63.7%。前 10個豐度最高的門類各占總體的99.082%—99.16%, 如圖3。各個胃含物樣品之間門水平上的豐度差異顯著, 其中鏈形植物門(Streptophyta)是長牡蠣胃含物中整體豐度最高的門類, 最低23.86%, 最高 49.66%, 平均 35.10%, 鏈型植物是植物中的一大類群, 包括輪藻門(廣義上的輪藻)和有胚植物(現存的陸生植物: 苔蘚維管植物)兩大類。5月(WH1)胃含物占 20%以上的門類有鏈形植物門和子囊菌門(Ascoaamycota)分別占 32.65%和 26.32%, 占10%以上的門類有綠藻門(Chlorophyta)和囊泡蟲門(Protalveolata)分別占14.31%和17.7%。在6月(WH2)胃含物占 20%以上的門類有鏈形植物門(Streptophyta)為49.66%, 占10%以上的門類是子囊菌門(Ascoaamycota)占18.14%, 7月(WH3)胃含物占20%以上的門類有鏈形植物門和囊泡蟲門(Protalveolata)分別占34.07%和44.72%。10月(WH4)胃含物樣品中占20%以上的門類為鏈形植物門23.89%。所有組樣品中除了WH3中囊泡蟲門含量最多, 其他3組樣品中都是鏈形植物門含量最多。

結果表明在 OTU水平上樣品之間差異明顯, 在表3中顯示了OTU豐度大于10%的樣品組, 如圖可以得知豐度大于10%的物種只有5種。4組胃含物樣品中的鏈形植物門(Streptophyta)都大于20%, 表明鏈形植物門是長牡蠣胃含物中的主要食物成分。

根據前10個豐度最高的屬聚類分析發現5月、6月、7月和10月真核生物成分差別明顯, 表明胃含物中真核生物成分顯著的季節性不同, 有一些成分只能鑒別到綱。如圖4, 并沒有石莼屬成分。WH1中梨屬(Pyrus), 四胞藻綱(Trebouxiophyceae)達到最多;WH2樣品中座囊菌屬(Dothidea)含量都達到所有樣品的最高值。WH3樣品中共甲藻屬(Syndiniales)、菥蓂屬(Thlaspi)成分達到最多。WH4樣品中溝鞭藻屬(Biecheleria)的含量達到最高值。

通過 PCoA(主成分分析)也可以確定樣品之間的關系(圖5)。PCoA結果顯示4組樣品之間是不同的,但也有相似之處。根據第一主成分可以看出5月和6月份樣品較為接近, 從第二主成分來看7月與其他月份差別最大。

圖2　樣品稀釋曲線(a)、Chao1指數(b)、4組樣品的Shanon多樣性指數(c)Fig.2 Richness and diversity: a. Sample rarefaction curves. b.Chaos1 curves. c. Shannon-Wiener indices of the four groups

圖3　胃含物中10個豐度最高門類相對豐度圖Fig.3 Relative abundance of 10 most abundant phyla in stomach content

表3　OUT豐度大于10%的樣品Tab.3 The OTUs whose abundance exceeded 10% in single samples

圖4　屬水平20個豐度最高門類相對豐度圖Fig.4 The relative abundance of 20 most abundant genus in stomach content

圖5　組間PCoA主坐標分析Fig.5 PCoA plots among the groups

3　討論

長牡蠣屬于濾食性貝類, 且食物源較復雜。使用傳統的顯微鏡技術鑒定這個物種的胃含物真核生物成分非常困難。我們使用了高通量DNA序列技術作為研究方法來鑒定長牡蠣胃含物中真核食物成分。目前已有研究通過18S rDNA方法鑒別海參胃含物的真核生物組成(Zhanget al, 2016)。我們共鑒定出15個門類的 105個 OTU, 每組樣品的 OTU數量范圍從38—84不等, 代表了 11—14個門, 而在屬水平共鑒定出105個屬, 表明長牡蠣胃含物真核生物成分較復雜, 食物源豐富。我們對石莼發生前后長牡蠣胃含物的研究結果顯示并沒有石莼屬成分。因此表明石莼屬不太可能作為長牡蠣的直接食物源。

現已有的關于胃含物的鑒定方法有COI(Lerayet al, 2013; Badeet al, 2014; Brownet al, 2014), ITS(Bachyet al, 2013)和18S rDNA序列分析(Martinet al,2006; Suzukiet al, 2008; Maloyet al, 2009; Riemannet al, 2010)三種。但是COI和ITS擴增片段與18S rDNA擴增相比更長, 且變異度較高, 只適用于攝食水平單一的物種胃含物分析, 由于長牡蠣的攝食成分較復雜因此選用18S rDNA序列分析。使用這種方法可以鑒別到屬水平而運用傳統的顯微鏡檢查大多只能觀察到門水平, 例如硅藻門(Lotsy, 1895); Galtsoff,1964), 因此這種方法更加精確全面, 可以為海洋動物攝食研究提供寶貴經驗(Lerayet al, 2013)。但這種方法也有其缺點, 一般食物在體內經過幾個小時或者幾天就會被完全消化, 因此這種方法只能提供短期的胃含物成分研究, 具有一定偶然性, 而穩定同位素分析和脂肪酸分析等方法可以對長牡蠣幾個月內甚至幾年內主要的食物來源進行對比分析, 想要研究長期的食物變化還需要結合穩定同位素分析和脂肪酸分析等方法共同分析。

研究結果顯示滸苔過境前后 4組不同時間相同地點的胃含物成分有著顯著變化。在四組樣品中通過18S rDNA分子方法分析長牡蠣的胃含物結果是不同的, 考慮到采樣時間跨越春季夏季和秋季三個季節,可能導致胃含物成分的顯著不同但不同組之間的生物豐度變化不顯著(P＞0.05), 胃含物中基本都是初級生產者而未發現次級消費者, 根據我們的檢測結果顯示長牡蠣主要攝食被子植物和小型浮游植物(如硅藻)這些初級生產者, 這與 Fukumori等(2008)的研究結果有不一致之處。在之前的研究中發現長牡蠣具有廣泛的營養可塑性, 因其食物源不止含有初級生產者還包括藤壺類, 甲殼類等次級消費者(Davenportet al, 2000; Lehaneet al, 2006; Fukumoriet al, 2008), 其不適合充當是一個初級生產力的表征。本次研究發現了胃含物中具有很高比例的高等植物, 蓂例如菥屬、梨屬、稻屬, 這種情況在已有的相關研究中并沒有提到過, 但并沒有檢測出浮游動物成分, 這可能與浮游動物豐度較低有關, 根據浮游動物檢測結果(表 2)顯示浮游動物與浮游植物相比含量顯著偏低, 這在某種程度上也說明了長牡蠣的營養可塑性, 表明長牡蠣的食物源不僅僅來源于海洋而且還攝食陸源有機質。由于本次研究地點位于離岸小島, 最近處距離海岸 42km, 而且附近沒有其他河流注入因此這些高等植物不太可能來自大陸, 推測高含量的被子植物可能來自小島自身的植被, 平島面積0.148km2, 目前在島上沒有發現種植大量稻屬植物和梨屬植物, 但島周圍地勢險惡無法近距離觀察, 不排除有野生稻屬植物和梨屬植物在此生長。平島周圍海域屬于當地公司承保養殖區, 常年有 4—6條漁船停靠或活動在島附近, 船員會將吃剩的飯菜或變質的食物直接倒入海水中, 經過海流的傳播, 這些剩菜剩飯的降解顆粒可能被附近的長牡蠣濾食, 可能會造成一定的污染,推測這也可能是稻屬植物可能的來源之一。在島上有大量軍事碉堡等建筑, 并且在島的最高處流動住有 2—5名士兵, 其生活垃圾都集中處理不會倒入海中,蓂因此不太可能來自島上垃圾。菥莫屬通常是一種野外生長的植物其花粉會隨著海風傳播到海水中, 其葉子等植物組織也會掉落腐敗后隨著雨水流入海水中被長牡蠣濾食, 這可能是長牡蠣濾食大量菥蓂屬的原因。因此未來使用雙殼貝類作為初級生產力的表征時, 應該考慮到長牡蠣的生活史和攝食模式的不同。

有研究表明滸苔的繁殖多以配子形式出現, 每平方厘米單層藻體葉片可以產生 2.84×106—6.62×106個孢子或配子(陳群芳等, 2011)。也有研究顯示滸苔的生殖囊釋放出的游孢子大小約為(9—12.5)μm×(5.3—6)μm; 配子相對較小, 約(5.8—8.5)μm×(2—2.8)μm (張華偉等, 2011), 孢子或兩個配子結合后形成的合子, 合子以成熟藻體為附著基繼續發育成一株新的藻體。一般浮游生物可分為六類: 巨型浮游生物, 大于1cm, 如海蜇; 大型浮游生物, 5—10mm, 如大型橈足類、磷蝦類; 中型浮游生物, 1—5mm, 如小型水母、橈足類; 小型浮游生物, 50μm—1mm, 如硅藻、藍藻; 微型浮游生物, 5— 50μm, 如甲藻、金藻;超微型浮游生物, 小于 5μm, 如細菌。因此我們推測滸苔繁殖體的粒徑與小型浮游植物和微型浮游植物相當。從滸苔微觀繁殖體的體積來看其可以作為長牡蠣的食物源, 由于本研究所使用的浮游植物網的網徑為 76μm, 大于一般的滸苔微觀繁殖體大小, 因此這可能是采集浮游植物時并沒有檢測到微觀繁殖體的原因, 但是大量滸苔出現在平島海域后, 長牡蠣的胃含物中也沒有檢測到石莼屬或滸苔屬成分, 推測可能有兩種可能: (1) 平島屬于滸苔暴發后自南向北漂移的通道區, 并沒有滸苔腐敗沉降因此沒有碎屑產生或產生量極少, 因此長牡蠣無法攝食滸苔。(2)此時的滸苔未到成熟期并沒有微觀繁殖體產生, 因此長牡蠣并沒有攝食。有研究表明黃海綠潮暴發過程中, 石莼屬綠藻的微觀繁殖體在海水和沉積物中是廣泛分布的, 并且生物量不容忽視。Liu等(2010, 2012)將采集到的微觀繁殖體帶回實驗室內重培養, 對長出的幼苗進行計數從而解決了微觀繁殖體的定量問題。張華偉等(2011)曾經指出在綠潮繁盛期, 一株飄浮的滸苔藻體可以產生 2.31×107個配子。Wang等(2013)利用熒光定量PCR的方法, 對綠潮暴發期間黃海石莼屬綠藻微觀繁殖體生物量的時空分布進行了定量研究, 結果發現微觀繁殖體的生物量在5月迅速上升, 平均數量為300—105cells/L, 5月中旬達到頂峰,約為 107cells/L。Zhang等(2015)曾指出自由漂浮的滸苔藻體在 5月份生物量急劇攀升, 因為滸苔微觀繁殖體的分布與水體中的滸苔藻體生物量呈現明顯正相關。

根據本次研究記錄平島滸苔出現至海面上可見滸苔消散的時間為6月11日—7月10日, 此時出現的滸苔比其微觀繁殖體數量的頂峰時期晚了將近一個月的時間, 雖然有大量滸苔藻體存在, 可能其微觀繁殖體數量已經開始減少。也有研究表明滸苔的配子具有正趨光性, 這趨光性使其更容易在光線較強的海面聚集并在漂浮藻體上附著生長, 滸苔成熟體有大量囊狀結構, 這些結構有利于藻體更好地漂浮在水面接受光照(張華偉等, 2011)。而長牡蠣生長在潮間帶, 當海水漲潮時長牡蠣生活在水下 3—6m, 本次研究地點長牡蠣生長在中潮間帶區, 只有落潮時長牡蠣才會浮出水面并且只有此時才能采集到長牡蠣樣品, 滸苔的這種生長特性與長牡蠣生長區在空間上產生一定分隔。因此也說明了水體中有大量滸苔而長牡蠣胃含物中沒有滸苔成分的原因。

4　結論

綜上所述, 滸苔暴發并不會直接影響長牡蠣的攝食情況, 因此推測滸苔通道區平島海洋牧場受滸苔危害影響較小, 應該更多關注滸苔漂移后的沉降區域并做好災害預防工作。使用高通量測序技術可以準確地鑒定胃含物成分但這種方法更多關注的是其短期的攝食情況, 未來研究雙殼貝類食物網時應該結合同位素分析和脂肪酸分析等多種分析方法, 這些方法可以關注到貝類的長期攝食情況, 以助于更好地了解雙殼貝類食物網結構。由于海州灣大規模滸苔暴發已經呈現常態化, 從長期角度來看可能會影響整個海洋漁業資源環境進而直接或間接對雙殼貝類營養成分造成影響, 因此應該全面加強監測滸苔對海洋環境的影響并做好生態風險評估。

張華偉, 馬家海, 胡 翔等, 2011. 綠潮漂浮滸苔繁殖特性的研究. 上海海洋大學學報, 20(4): 600—606

張繼紅, 2008. 濾食性貝類養殖活動對海域生態系統的影響及生態容量評估. 青島: 中國科學院海洋研究所博士學位論文, 20—25

陳群芳, 何培民, 馮子慧等, 2011. 漂浮綠潮藻滸苔孢子/配子的繁殖過程. 中國水產科學, 18(5): 1069—1076

Bachy C, Dolan J R, López-García Pet al, 2012. Accuracy of protist diversity assessments: morphology compared with cloning and direct pyrosequencing of 18S rRNA genes and ITS regions using the conspicuous tintinnid ciliates as a case study. ISME J, 7(2): 244—255

Backeljau T, De Bruyn L, De Wolf Het al, 1996. Multiple UPGMA and neighbor-joining trees and the performance of some computer packages. Mol Biol Evol, 13(2): 309—313

Bade L M, Balakrishnan C N, Pilgrim E Met al, 2014. A genetic technique to identify the diet of cownose rays,Rhinoptera bonasus: analysis of shellfish prey items from North Carolina and Virginia. Environ Biol Fish, 97(9): 999—1012

Bokulich N A, Mills D A, 2013. Improved selection of internal transcribed spacer-specific primers enables quantitative,ultra-high-throughput profiling of fungal communities. Appl Environ Microbiol, 79(8): 2519—2526

Brown D S, Burger R, Cole Net al, 2014. Dietary competition between the alien Asian Musk Shrew (Suncus murinus) and a re-introduced population of Telfair’s Skink (Leiolopisma telfairii). Mol Ecol, 23(15): 3695—3705

Callow M E, Callow J A, Pickett-Heaps J Det al, 1997. Primary adhesion ofEnteromorpha(chlorophyta, ulvales) propagules:quantitative settlement studies and video microscopy. J Phycol, 33(6): 938—947

Chapman A R O, 1986. Population and Community Ecology of Seaweeds. In: Blaxter J H S, Southward A J eds. Advances in Marine Biology. London: Academic Press, 1—161

Cheung M K, Au C H, Chu K Het al, 2010. Composition and genetic diversity of picoeukaryotes in subtropical coastal waters as revealed by 454 pyrosequencing. ISME J, 4(8):1053—1059

Davenport J, smith R J J W, Packer M, 2000. MusselsMytilus edulis: significant consumers and destroyers of mesozooplankton. Mar Ecol Prog Ser, 198: 131—137

Fletcher R L, Callow M E, 1992. The settlement, attachment and establishment of marine algal spores. British Phycol J, 27(3):303—329

Fukumori K, Oi M, Doi Het al, 2008. Food sources of the pearl oyster in coastal ecosystems of japan: evidence from diet and stable isotope analysis. Estuar, Coastal Shelf Sci, 76(3):704—709

Galtsoff P S, 1964. The American oyster Crassostrea virginica Gmelin. Fish Bull, 64: 1—480

Hiraoka M, Ohno M, Kawaguchi Set al, 2004. Crossing test among floating ulva, thalli forming green tide in japan.Hydrobiologia, 512(1—3): 239—245

Jones C G, Lawton J H, Shachak M, 1996. Organisms as Ecosystem Engineers. In: Samson F B, Knopf F eds.Ecosystem Management. New York, USA: Springer Press,130—147

Lehane C, Davenport J, 2006. A 15-month study of zooplankton ingestion by farmed mussels (Mytilus edulis) in Bantry Bay,Southwest Ireland. Estuar Coastal Shelf Sci, 67(4):645—652

Leray M, Yang J Y, Meyer C Pet al, 2013. A new versatile primer set targeting a short fragment of the mitochondrial COI region for metabarcoding metazoan diversity: application for characterizing coral reef fish gut contents. Front Zool, 10(1):34

Liu F, Pang S J, Zhao X Bet al, 2012. Quantitative, molecular and growth analyses ofUlvamicroscopic propagules in the coastal sediment of Jiangsu province where green tides initially occurred. Mar Environ Res, 74: 56—63

Liu D Y, Keesing J K, Dong Z Jet al, 2010. Recurrence of the world’s largest green-tide in 2009 in Yellow Sea, China:Porphyra yezoensisaquaculture rafts confirmed as nursery for macroalgal blooms. Mar Pollut Bull, 60(9): 1423—1432

Lotsy J P, 1895. The food of the oyster, clam, and ribbed mussel.Rept US Comm Fish, 1893(19): 375

Mago? T, Salzberg S L, 2011. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics,27(21): 2957—2963

Maloy A P, Culloty S C, Slater J W, 2009. Use of PCR-DGGE to investigate the trophic ecology of marine suspension feeding bivalves. Mar Ecol Prog Ser, 381: 109—118

Martin D L, Ross R M, Quetin L Bet al, 2006. Molecular approach (PCR-DGGE) to diet analysis in young Antarctic krillEuphausia superba. Mar Ecol Prog Ser, 319: 155—165

Mueller R C, Paula F S, Mirza B Set al, 2014. Links between plant and fungal communities across a deforestation chronosequence in the Amazon rainforest. ISME J, 8(7):1548—1550

Riemann L, Alfredsson H, Hansen M Met al, 2010. Qualitative assessment of the diet of European eel larvae in the Sargasso Sea resolved by DNA barcoding. Biol Lett, 6(6): 819—822

Santelices B, Aedo D, Hoffmann A, 2002. Banks of microscopic forms and survival to darkness of propagules and microscopic stages of macroalgae. Revista Chilena de Historia Natural, 75: 547—555

Suzuki N, Hoshino K, Murakami Ket al, 2008. Molecular diet analysis of phyllosoma larvae of the Japanese spiny lobsterPanulirus japonicus(Decapoda: Crustacea). Mar Biotechnol,10(1): 49—55

Tel-Zur N, Abbo S, Myslabodski Det al, 1999. Modified CTAB procedure for DNA isolation from epiphytic cacti of the genera Hylocereus and Selenicereus (Cactaceae). Plant Mol Biol Rep, 17(3): 249—254

Wang R J, Wang Y, Zhou Jet al, 2013. Algicidal activity ofUlva pertusaandUlva proliferaonProrocentrum donghaienseunder laboratory conditions. African J Microbiol Res, 7(34):4389—4396

Zhang Q C, Liu Q, Yu R Cet al, 2015. Application of a fluorescencein situhybridization (FISH) method to study green tides in the Yellow Sea. Estuar Coast Shelf Sci, 163:112—119

Zhang H Y, Xu Q, Zhao Yet al, 2016. Sea cucumber(Apostichopusjaponicus) eukaryotic food source composition determined by 18S rDNA barcoding. Mar Biol,163: 153