黃東海奇異指紋蛤Acila mirabilis和指紋蛤Acila divaricata群體遺傳多樣性及進化研究*

胡利莎 張 振 崔宗梅 王海艷①

(1. 中國科學院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京 100049)

奇異指紋蛤Acila mirabilis(Adams and Reeve,1850)和指紋蛤A. divaricata(Hinds, 1843)隸屬于胡桃蛤科Nuculidae, 指紋蛤屬Acila。因為兩者的形態相似性較高, 僅通過形態學特征很難將兩者區分開。所以很多研究者認為奇異指紋蛤是指紋蛤的同物異名(Habe, 1958, 1977; Knudsen, 1967; Lutaenkoet al,2012)。但也有很多研究認為它們是兩個種(Hanley,1860; Bernardet al, 1993; 徐鳳山等, 2008; Huber,2010)。Zhang等(2014)通過形態學和COI基因標記對兩者的分類地位進行分析, 認為奇異指紋蛤和指紋蛤為兩個不同的種, 二者在形態上也有明顯差異: 奇異指紋蛤自殼頂到后腹緣的脊更明顯, 脊上通常有一組人字形刻紋; 而指紋蛤這一脊不明顯, 脊上的刻紋是殼表刻紋的延續。另外, 奇異指紋蛤和指紋蛤的殼大小不同, 指紋蛤更小, 殼長通常不超過 15mm,奇異指紋蛤殼長可達30mm。對于殼大小相近的樣品,指紋蛤鉸合齒更加粗壯。奇異指紋蛤和指紋蛤的分布也不同, 奇異指紋蛤分布于黃海、日本北部和俄羅斯遠東海, 而指紋蛤分布于東海、南海和日本(徐鳳山等,2008)。Huber(2010)和 Zhang等(2014)均認為菲律賓的A. divaricata balabacensis應該也是指紋蛤。另外Zhang等(2014)認為日本所報道的指紋蛤以及日本深海的A. schencki archibenthalis應均為奇異指紋蛤。臺灣有關文獻記錄的指紋蛤大小可達 45mm, 也是奇異指紋蛤(Zhanget al, 2014)。

目前, 有關黃海和東海指紋蛤屬物種的研究多集中在群落結構組成的分析上(劉瑞玉等, 1963, 1986;Zhanget al, 2012; 彭松耀, 2013; Liu, 2013; 張鵬弛等,2016), 而對于奇異指紋蛤和指紋蛤的進化關系研究較少。為了解冷水種奇異指紋蛤的群體遺傳多樣性以及其與指紋蛤的遺傳分化水平, 我們在黃海和東海對這二種貝類進行集中采樣, 利用線粒體COI(mtCOI)基因進行標記, 從分子水平追蹤并探討指紋蛤屬這兩個常見種的分化歷程和不同群體的遺傳多樣性, 以期為黃、東海生物多樣性研究提供分子生物學基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與樣品制備

實驗所需樣品采自于黃海、東海, 每群體個體數量為 19—20個, 樣品采集后立即用 95%酒精固定,保存備用。圖1為樣品采集站位的分布, 各采集站位的經緯度和采集數量見表1。冷水團的位置一年四季會有變化, 7月份在南黃海形成的冷中心覆蓋本研究涉及的站位, 且3500-10相對靠近冷中心內側。

圖1　奇異指紋蛤和指紋蛤采樣站位區域分布圖Fig.1 Map of sampling site for A. mirabilis and A. divaricate

1.2　DNA的提取、擴增及測序

取閉殼肌肌肉約100mg, 充分剪碎后, 用TIANamp海洋動物 DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)提取全基因組DNA。

基因擴增所用引物為 LCO1490 (5′-GGTCAAC AAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198 (5′-AAA CTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′) (Folmeret al,1994), 由生工生物科技有限公司合成。PCR反應體系 包 括 : 2μL 10×PCR buffer, 1.5mmol/L Mg2+,200μmol/L dNTPs, 1U Taq DNA polymerase, 正、反向引物各0.4μmol/L, 1.5μL 模板DNA溶液(10—100ng/μL), 最后用超純水補充至25μL。PCR擴增反應程序為: 預變性 94°C 5min; 94°C 30s, 48—52°C 1min,72°C 1min, 循環 30—35 次; 總延伸 72°C 10min。

PCR產物經1%—1.5%瓊脂糖電泳凝膠純化, 送生工生物科技有限公司進行雙向測序, 測序引物用擴增時的LCO1490和HCO2198。

1.3　數據分析

DNA序列結果由CLUSTAL X軟件(Thompsonet al, 1997)采用默認參數比對, 然后經人工校對后用于分析。

對位后將堿基序列輸入DnaSP 5軟件(Rozaset al,2003)統計單倍型, 并統計單倍型在各采樣站位的分布情況。各物種不同群體的多樣性指數, 如單倍型數(h)、核苷酸多樣性指數(π)、單倍型多樣性指數(H)、平均核苷酸差異數(k)等, 通過Arlequin 3.5 (Excoffieret al, 2010)進行計算。

1.3.1系統發生分析使用ModelTest 3.7 (Posadaet al, 2004)基于 Akaike Information Criterion (AIC)選擇核苷酸最佳替代模型為 GTR+I+G。獲得的最佳替代模型用于構建最大似然(ML)樹和貝葉斯(BI)樹, 將近緣的胡桃蛤屬Nucula中的橄欖胡桃蛤Nucula tenuis作為外群, 用MrBayes3.2 (Ronquistet al, 2003)軟件構建BI樹, 用PhyML3.0 (Guindonet al, 2003)軟件構建 ML樹。另外用軟件 Hapstar (Teacheret al,2011)構建單倍型網絡關系圖來探討單倍型的譜系結構。NJ樹在軟件Mega 7 (Kumaret al, 2016)中完成,采用Kimura-2 parameter (K-2P) (Kimura, 1980)計算方法, 用步長值法(Bootstrapping method)估算每個分支1000次重復下的支持度。

1.3.2物種分化時間計算由于缺乏化石或地理記錄, 目前還沒有針對指紋蛤屬貝類計算的序列分歧速率, 本研究采用其他貝類(貽貝屬及蚶科物種) mtCOI基因的分歧速率(2%—2.4%/百萬年)(Marko, 2002; Markoet al, 2010)進行分析, 推算指紋蛤屬物種的分化時間(divergent time,t)。并將指紋蛤屬貝類的地理分布與地理歷史事件相結合探討其起源及進化歷史。GenBank中已有 COI序列的A.insignis(GenBank number: LC144801)、A. castrensis(KC603848, KC429087)和A. minutoides(LC144800)也加入分析。

使用 BEAST v.1.7.5的寬松分子鐘方法(relaxed uncorrelated lognormal clock)估計指紋蛤屬起源與分化時間。參數設置為Speciation=Yule process, ngen=10,000,000, log parameter every=1000。TreeAnnotator burn-in=100, 校準點(calibration point)設置為正態分布。最后整合出的系統進化樹用 FigTree v1.4查看。

1.3.3群體遺傳結構及種群歷史動態分析種內群體間遺傳分化系數(F-statistics,FST)及其顯著性(10000次重復)用Arlequin 3.5軟件計算。

中性檢驗 Tajima’sD(Tajima, 1989a)和 Fu’sFs(Fu, 1997)以及核苷酸不配對分布圖(Mismatch distribution)均在Arlequin 3.5軟件中計算得到。根據中性檢驗Tajima’sD和Fu’sFs參數可評估種群是否經歷過歷史上種群擴張事件。如果D和Fs為顯著負值就說明種群經歷過歷史上擴張(Tajima, 1989b)。此外, 核苷酸不配對分布圖也能反應出種群是否經歷過擴張(Rogerset al, 1992): 單峰說明種群近期經歷過種群擴張; 而多峰則說明種群處于平衡階段。根據公式τ=2μt估算種群擴張時間,τ可在Arlequin 3.5中得到,μ為序列每代核苷酸的突變速率,t為擴張時間。

2　結果

2.1　系統發生及物種分化時間

測序結果經過人工校對, 共獲得 79個奇異指紋蛤個體和60個指紋蛤個體的mtCOI序列, 其長度為641bp(如表 1)。

表1　奇異指紋蛤和指紋蛤采樣信息及遺傳多樣性參數Tab.1 The sampling information and genetic parameters of A. mirabilis and A. divaricata

Dnasp分析統計表明, 奇異指紋蛤 79條序列共有50個單倍型, 指紋蛤60條序列共有41個單倍型, 單倍型分布如表2和表3所示。指紋蛤的核苷酸多樣性明顯高于奇異指紋蛤。奇異指紋蛤群體中3500-10的多樣性最高, 3600-06多樣性最低。指紋蛤群體中DH5-5的多樣性最高, DH6-4多樣性最低。

通過PhyML構建的ML樹和MrBayes構建的BI樹如圖2所示, 兩種發生樹得到的拓撲結構相同, 奇異指紋蛤所有單倍型聚在一起, 指紋蛤所有單倍型聚在一起。

基于奇異指紋蛤所有單倍型和指紋蛤所有單倍型構建的單倍型網絡圖分別如圖3和圖4所示, 其結構基本上均呈“星狀”。奇異指紋蛤的中間單倍型 Q8的數量最多, 占總數的10.13%, 為群體共有單倍型。指紋蛤的中間單倍型ZA1數目最多, 占總數的20%,為群體共有單倍型。指紋蛤單倍型網絡圖包括兩個“星狀”分支, 與單倍型鄰接樹(圖 5)的結果一致, 所以認為指紋蛤單倍型存在A、B兩個類群(標記為ZA和 ZB)。

根據 mtCOI 基因 2%—2.4%/百萬年的分歧速率計算, 指紋蛤從其余四個種的共同祖先中分化出來的時間大約是 4.27百萬年前。奇異指紋蛤從A.insignis、A. castrensis和A. minutoides的共同祖先中分化出來的時間大約是3.71百萬年前。A. insignis大約在 1.79百萬年前分化出來,A. castrensis和A.minutoides的分化時間大約在1.36百萬年前。

指紋蛤兩類群 ZA和 ZB的分化時間大約是 64萬年前。

2.2　群體遺傳結構及種群歷史動態

奇異指紋蛤和指紋蛤種內群體間FST結果如表4所示。奇異指紋蛤和指紋蛤群體間均未形成明顯的遺傳分化, 只有奇異指紋蛤的3500-10與3600-06群體間存在弱的遺傳分化。指紋蛤兩兩群體間的FST存在負值, 說明群體內的遺傳差異大于群體間的遺傳差異。

表2　奇異指紋蛤單倍型在各群體中的分布Tab.2 The distribution of haplotypes of A. mirabilis in different populations

表3　指紋蛤單倍型在各群體中的分布Tab.3 The distribution of haplotypes of A. divaricata in different populations

奇異指紋蛤和指紋蛤各群體的中性檢驗 Fu’sFs和Tajima’sD結果如表5所示, 奇異指紋蛤各個群體的Fu’sFs及Tajima’sD檢驗值均為顯著負值, 說明在其歷史上各群體均經歷了種群擴張。

指紋蛤群體只有DH6-4和DH7-2兩個群體Fu’sFs為顯著負值, 3個群體的Tajima’sD及DH5-5群體的Fu’sFs為負值, 但不顯著。

圖2　指紋蛤屬基于COI單倍型構建的系統發生樹Fig.2 Phylogenetic tree of Acila based on COI haplotypes of A. mirabilis and A. divaricata and other sequences downloaded from theGenBank

核苷酸不配對分布如圖6和圖7所示, 奇異指紋蛤不同群體的核苷酸不配對分布圖均為單峰, 也支持種群歷史上的擴張。指紋蛤總體及不同群體的核苷酸不配對分布圖均為雙峰, 其中一個峰對應各類群內序列間的差異, 另一個峰對應兩個類群序列間差異。

通過Arlequin 3.5軟件計算的τ值(表6所示)可知,奇異指紋蛤3500-10群體最早經歷種群擴張, 大約在0.17—0.42百萬年前; 3600-06種群擴張時間最晚, 大約在0.09—0.27百萬年前。

對指紋蛤 ZA和 ZB兩個類群分別統計 Fu’sFs和Tajima’sD, 結果除ZB類群的Tajima’sD不顯著外,其余均為顯著負值(表 7)。對兩個類群分別進行核苷酸不配對分析, 結果均為單峰, 表明兩類群均經歷了群體擴張(圖8)。

根據τ值可知(表 8), 指紋蛤 ZA 類群大約在0.14—0.35百萬年前擴張, ZB類群大約在0.33—0.87百萬年前擴張。

圖3　奇異指紋蛤單倍型網絡圖Fig.3 The median-joining network of A. mirabilis haplotypes

圖4　指紋蛤單倍型網絡圖Fig.4 The median-joining network of A. divaricata haplotypes

圖5　指紋蛤單倍型鄰接關系樹(NJ樹), 支上數值表示bootstrap值＞50%Fig.5 The NJ tree of haplotypes of A. divaricata, the numbers at the nodes are bootstrap values ＞50%

表4　奇異指紋蛤和指紋蛤種內兩兩群體間FST比較分析Tab.4 FST values between populations within species A.mirabilis and A. divaricata

3　討論

3.1　指紋蛤屬物種分化

線粒體COI基因是動物DNA條形碼的有效目標片段, COI序列對于很多種的鑒定來說都是有效的“條形碼”(Hebertet al, 2003)。并且其分子進化速率較高, 因而常用于分辨親緣關系相近的類群(Hebertet al, 2003; Galtieret al, 2009)。本研究以COI基因作為分子標記, 分析結果表明黃海的奇異指紋蛤和東海的指紋蛤為兩個不同的種。支持Zhang等(2014)的研究結果。

通過 mtCOI基因的分歧速率計算可知, 在分析的五個種中, 指紋蛤大約在 4.27百萬年前最早分化出來, 再依次是奇異指紋蛤(3.71百萬年前),A.insignis(1.79百萬年前),A. castrensis和A. minutoides分化時間最晚, 大約在1.36百萬年前。

表5　奇異指紋蛤和指紋蛤各群體的Fu’s Fs和Tajima’s DTab.5 Fu’s Fs and Tajima’s D test of populations within species A. mirabilis and A. divaricata

圖6　奇異指紋蛤群體核苷酸不配對分布圖Fig.6 Pairwise distribution of A. mirabilis populations

圖7　指紋蛤群體核苷酸不配對分布圖Fig.7 Pairwise distribution of A. divaricata populations

表6　奇異指紋蛤群體擴張參數Tab.6 Expansion parameters of A. mirabilis populations

表 7 指紋蛤ZA和ZB兩類群的Fu’s Fs和Tajima’s DTab.7 Fu’s Fs and Tajima’s D test of ZA and ZB groups within species A. divaricata

圖8　指紋蛤ZA和ZB兩類群核苷酸不配對分布圖Fig.8 Pairwise distribution of ZA and ZB groups of A. divaricata

表8　指紋蛤ZA和ZB兩類群群體擴張參數Tab.8 Expansion parameters of A. divaricata populations

目前很多研究表明, 冰期時幸存在不同海盆或者內海中的海洋生物, 由于相互之間缺乏基因交流,促進了海區間物種的演化, 導致了目前新種或者隱存種的出現。如青蛤分化為三個譜系, 且分別對應三個邊緣海(倪剛, 2013)。

指紋蛤和奇異指紋蛤分化出來的時間處于上新世。上新世冰期與間冰期的交替出現顯著影響了西北太平洋邊緣海的區域和架構(Wang, 1999)。冰期階段海平面下降, 邊緣海之間相互隔離, 不同邊緣海內的種群因喪失基因交流而發生分化。我們認為冰期時東海成為指紋蛤屬貝類的避難所, 從而使指紋蛤分化形成, 而間冰期海平面上升, 物種向北擴張至黃海,向南擴張至臺灣東北部, 擴張至黃海的物種與保留在東海的物種由于環境的差異, 因適應不同的環境而逐漸分化形成兩個不同的種, 即本研究中討論的奇異指紋蛤和指紋蛤, 這一結果與前人的觀點(徐鳳山等, 2011; Zhanget al, 2014)一致。

目前 WoRMS (http://www.marinespecies.org/)和WMSD (http://www.bagniliggia.it/WMSD/ WMSD home. htm)記錄顯示A. insignis分布于中國浙江和日本海域, 我們分析的序列來自日本海域的樣品。該種的分化時間為 1.79萬年前, 這一時間與對馬海峽的形成時間(1.52—1.71) (Kitamuraet al, 2001)較接近,這一時期日本海海平面明顯低于現在, 洋流僅通過對馬海峽涌入日本海, 并無洋流從對馬海峽流出(Kitamuraet al, 2006)。因此我們認為對馬海峽的屏障作用促進了A. insignis的形成。

A. minutoides的分布水域是中國浙江和日本九州,結合其分化形成時間 1.36百萬年前, 推測A.castrensis和A. minutoides的共同祖先由中國遷移至日本, 由于對馬海峽的屏障作用, 缺少與中國海之間的基因交流以及對當地環境的適應, 最終導致兩種的形成, 其形成也與冰期、間冰期的交替出現有關。

A. castrensis分布于日本、加利福尼亞、加拿大及加倫比亞。我們推測該種可能最先在日本形成, 然后通過海流的作用遷移至目前的這些分布區。這些推測假設需要對該種進行大面積采樣, 進一步的分析進而給予較為全面的解釋。

綜上所述, 就分析的五個種來看, 指紋蛤屬的祖先種群可能位于中國東海。后期對指紋蛤屬所有現存種進行系統演化及動物地理學研究, 不僅能夠驗證我們的推測, 對我們理解物種的起源及進化歷史也有很大的指導意義。

3.2　目前群體遺傳結構的形成

奇異指紋蛤作為黃海常見的冷水種, 其分布也主要集中在冷水團區域及邊緣區域。通過分析發現,除 3500-10與 3600-06群體間存在弱的遺傳分化外,其余群體間不存在顯著的遺傳差異。說明其對分布區域適應性強, 群體間存在較強的基因交流。從遺傳多樣性水平上看, 3500-10群體的多樣性水平最高, 且由冷水中心內側至冷水中心外側多樣性呈遞減趨勢。除3500-10群體外, 其余3群體的遺傳多樣性均為高的單倍型多樣性(H＞0.5)和低的核苷酸多樣性(π＜0.005), 符合 Grant等(1998)根據不同核苷酸多樣性和單倍型多樣性間組合的第二種類型, 該類型是由于瓶頸效應后種群擴張以及突變積累所形成, 說明這3個群體經歷了群體擴張, 與本研究中單倍型網絡圖、核苷酸不配對分析以及中性檢驗結果相一致。而3500-10群體為第四種類型, 這是由于一個大而穩定的種群經過長時間演化所產生或兩個不同種群二次接觸所造成, 本研究認為是該群體形成后穩定的長時間的演化所產生的。綜上所述, 我們推測3500-10可能是本研究中所有奇異指紋蛤類群的祖先群體, 其余群體的形成受冷水團水流的影響(Savolainenet al, 2002)。

指紋蛤主要分布于東海、南海68—162m深水處(徐鳳山等, 2008), 因樣品數量有限, 本研究僅分析了東海3個群體的遺傳多樣性及群體遺傳結構。研究結果表明, 指紋蛤3個群體的遺傳多樣性水平均較高,符合 Grant等(1998)提出的第四種類型, 這可能是由于不同種群二次接觸造成的, 即由歷史上發生過異域分化, 隨后分化的類群間再次混合發生二次接觸形成(Avise, 2000)。指紋蛤單倍型網絡圖及中性檢驗結果均支持這一推測, 即每個群體內都存在2個分化的類群。在一些魚類和蟹類的研究中也有與該模式類似的報道(Liuet al, 2007; Wanget al, 2008; 殷維,2010)。根據 mtCOI基因2%—2.4%/百萬年的分歧速率計算, 指紋蛤兩類群ZA和ZB的分化時間大約是64萬年前, 發生于更新世中期。冰期時, 海平面發生強烈的變化, 尤其是在冰期盛行時期, 海平面下降最大, 約120—140m (Lambecket al, 2002)。冰期海平面下降, 東海大陸架裸露成為陸地, 海洋生物的生物量減少, 只有少數幸存個體殘存于有限的避難所內, 而臨時避難所的相互隔離, 最終導致了指紋蛤群體產生分化。冰期過后, 海平面上升, 指紋蛤可能由冰期時的臨時避難所發生殖化事件, 從而使得先前被隔離的群體間發生混合, 從而形成了目前的群體結構。另外, 一個大而穩定的群體經過長時間演化也可能出現顯著的分化。結合貝類成體前的幼體浮游階段的生活史, 我們認為這也可能是在指紋蛤群體內檢測到兩個分化類群的原因。

我們發現指紋蛤的 3個群體位于黑潮分支流-近岸黑潮底層分支(NKBC)流經區域附近, 所以我們認為東海大面積的群體采樣以及補充南海群體樣品進行指紋蛤詳細的群體遺傳結構的分析, 將會更好地闡釋其進化模式。

4　結論

本研究結果支持前人的研究, 即奇異指紋蛤和指紋蛤是指紋蛤屬在黃海和東海不同海域分布的兩個不同種。兩種的分化可能與冰期時海平面的升降及環境的適應性有關。奇異指紋蛤和指紋蛤不同群體間不存在顯著的差異, 而指紋蛤單倍型存在兩個分化的類群, 說明其在歷史上經歷過隔離分化。

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