葉片接種方式和暗培養(yǎng)時間對青砧1號不定芽再生的影響

葛紅娟，蘭嵐，馬榮群，沙廣利，郝玉金

(1.青島市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東青島 266000；2.山東農(nóng)業(yè)大學；3.青島市農(nóng)業(yè)廣播電視學校)

葉片接種方式和暗培養(yǎng)時間對青砧1號不定芽再生的影響

葛紅娟1,2，蘭嵐3，馬榮群1，沙廣利1，郝玉金2*

(1.青島市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東青島 266000；2.山東農(nóng)業(yè)大學；3.青島市農(nóng)業(yè)廣播電視學校)

以青砧1號組培苗為試材，探討葉片的接種方式和暗培養(yǎng)時間對葉片不定芽再生的影響。結果表明，以葉背面接觸培養(yǎng)基且暗培養(yǎng)3天的葉片不定芽再生數(shù)最多，葉片最優(yōu)。

青砧1號；葉片接種方式；暗培養(yǎng)；不定芽再生

蘋果(Maluspumila)矮化密植是現(xiàn)代蘋果生產(chǎn)發(fā)展的趨勢[1]。選用適宜的矮化砧木是實現(xiàn)矮化密植的主要途徑之一。國內(nèi)應用的矮化砧木有GM256、SH6、M9、M26等，多用作于中間砧[2]，這與國外主要推廣的自根砧方式[3]相比存在成活率低、個體差異大、整齊度偏低等問題。

青砧1號是從平邑甜茶與柱形蘋果株系雜交后代中選育成的無融合生殖蘋果砧木，具有結果早、抗逆性強，與多個主栽品種的嫁接親和能力強[4,5]等優(yōu)點，能通過種子繁殖，根系發(fā)達，整齊度達85%以上，是適宜推廣的良好的蘋果砧木。

青砧1號也存在一些不足，如易發(fā)白粉病等。采用轉(zhuǎn)基因技術是現(xiàn)階段改良性狀的主要途徑之一。周瑞金等[6]通過微嫁接技術，驗證了蘋果外源nptⅡ基因只在轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)表達，不通過嫁接在接穗和砧木間進行傳導。李永紅[7]成功轉(zhuǎn)化蘋果砧木M26，并提高其抗鹽性。李海云[8]優(yōu)化了 GM256和M9的遺傳轉(zhuǎn)化體系。吳瑞剛等[9]建立了青砧1號的高效離體再生體系，但就葉片的接種方式和光照條件的優(yōu)化未見討論。筆者參考吳瑞剛等[9]報道的最優(yōu)再生培養(yǎng)基配方，研究青砧1號組培苗葉片的不同接種方式和暗培養(yǎng)時間對葉片不定芽再生的影響，進一步優(yōu)化高效再生體系，為轉(zhuǎn)基因技術的應用打好前期基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

2015年4月中旬，于晴朗天氣剪取青島市農(nóng)業(yè)科學研究院北宅基地向陽、健壯、無病害的青砧1號植株的新梢，立即置于冰盒帶回實驗室，進行表面清洗，酒精和升汞復合消毒，無菌水清洗3次。將消毒新梢莖尖置于初代培養(yǎng)基MS +6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.01 mg/L上培養(yǎng)。選擇初代培養(yǎng)的無污染、生長狀態(tài)旺盛的植株繼續(xù)擴繁，繼代培養(yǎng)基與初代培養(yǎng)基配方一致。每20天繼代1次，多次繼代后，獲得足夠的試驗植株。

1.2 試驗方法

取生長一致的青砧1號組培苗莖尖，統(tǒng)一轉(zhuǎn)接至同一批次繼代培養(yǎng)基中。20天后，取完全展開、顏色深綠的葉片，沿主脈垂直方向劃傷葉片準備接種(劃3道，不斷開)。接種方式設置為葉片正面接觸培養(yǎng)基和葉片背面接觸培養(yǎng)基，每培養(yǎng)基各4片，分兩行整齊排列于同一瓶中；暗培養(yǎng)時間設為0天、3天、7天、14天，每個時間點處理3瓶，取出后置于16小時光照、8小時暗培養(yǎng)周期下培養(yǎng)，20天后觀察葉片不定芽的再生情況，統(tǒng)計再生不定芽數(shù)和生長情況。

2 結果與分析

如圖1，青砧1號葉片不定芽的再生數(shù)，以葉片背面接觸培養(yǎng)基的高于以葉片正面接觸培養(yǎng)基的。不同暗培養(yǎng)時間對青砧1號的葉片不定芽再生有影響。隨著暗培養(yǎng)時間的延長，兩種接種方式的葉片不定芽再生數(shù)均呈先增加再減少的趨勢。暗培養(yǎng)時間為0天時，兩種接種方式的葉片不定芽再生數(shù)均為0；暗培養(yǎng)時間為3天時，兩種接種方式的葉片不定芽再生數(shù)均最多，葉片背面接觸培養(yǎng)基的可達到12個以上；暗培養(yǎng)時間為7天時，葉片不定芽再生數(shù)少于暗培養(yǎng)3天的；暗培養(yǎng)14天時，兩種接種方式的葉片不定芽再生數(shù)更少，葉片正面接觸培養(yǎng)基的不定芽再生數(shù)為0，葉片背面接觸培養(yǎng)基的幾乎為0。

圖1 接種方式和暗培養(yǎng)時間對青砧1號葉片不定芽再生的影響

圖2為青砧1號組培苗葉片不同接種方式和暗培養(yǎng)時間的葉片不定芽再生的情況。葉片正面接觸培養(yǎng)基脫分化形成愈傷組織比葉片背面接觸培養(yǎng)基的時間早；但后期分化階段生長較為緩慢。同時，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，葉片的顏色逐漸減淡，愈傷組織顏色由深紅變?yōu)槿榘咨?/p>

圖2 組接種方式和暗培養(yǎng)時間對青砧1號葉片不定芽再生的影響

3 小結與討論

青砧1號組培苗葉片接種于培養(yǎng)基誘導不定芽再生，葉片不同的接種方式和暗培養(yǎng)時間對葉片不定芽的再生均有影響。葉片不定芽再生數(shù)，以葉片背面接觸培養(yǎng)基時高于葉片正面接觸培養(yǎng)基時；暗培養(yǎng)有助于愈傷組織的誘導[14]，在光照培養(yǎng)條件下愈傷組織才出現(xiàn)不定芽。適合青砧1號的葉片不定芽再生的最佳接種方式為葉片背面接觸培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)3天時葉片不定芽再生數(shù)最多。這與魏國芹等[12]的暗培養(yǎng)14天最佳的結果稍有不同。

在不同接種方式的試驗中發(fā)現(xiàn)，當葉片正面接觸培養(yǎng)基時，葉片在劃傷處能夠較早的出現(xiàn)愈傷組織，并多出現(xiàn)在葉片最寬處。這可能與葉片能夠較為平整并較大面積接觸培養(yǎng)基有關。此結果與李艷紅等[13]報道的蘋果砧木M26 愈傷組織發(fā)生時間以葉背面朝上放置略早于葉正面朝上放置的研究結果一致。當葉片正面接觸培養(yǎng)基時，葉柄和葉尖處遠離培養(yǎng)基，僅葉片的中間一點與培養(yǎng)基接觸并參與激素的運輸，這可能是其愈傷組織后期分化緩慢的主要原因；而葉片背面接觸培養(yǎng)基時，葉片中間部位翹起，形成拱橋狀，葉柄和葉尖接觸培養(yǎng)基，葉片的葉柄處是最早出現(xiàn)愈傷組織的部位，葉柄處內(nèi)含大量的維管組織參與激素和營養(yǎng)成分的運輸，使得愈傷組織能夠快速分化成不定芽。以上可能是葉片背面接觸培養(yǎng)基的再生數(shù)遠大于葉片正面接觸培養(yǎng)基的主要原因。

不同材料對葉片接種方式和暗培養(yǎng)時間的反應有所不同。張瑞越等[10]認為，麗格海棠葉片誘導分化培養(yǎng)時，葉片反放的接種方式優(yōu)于葉片正放。師校欣等[11]對甜櫻桃砧木葉片接種方式的再生情況發(fā)現(xiàn)：葉片背面接觸培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式為優(yōu)。魏國芹等[12]對平邑甜茶和M7葉片的接種方式和暗培養(yǎng)時間與再生的關系研究結果表明，適合二者葉片不定芽再生的最佳暗培養(yǎng)時間14天，平邑甜茶葉片背面接觸培養(yǎng)基再生效果好，葉片接種方式對M7葉片不定芽再生無顯著影響。

[1] 韓振海.蘋果矮化密植栽培-理論與實踐[M] 北京:科學出版社,2011.

[2] 劉國榮,陳海江,徐繼忠,等.矮化中間砧對紅富士蘋果果實品質(zhì)的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2007,30(4): 24-26.

[3] 原永兵, 劉成連, 馬德功,等.歐洲蘋果矮化自根砧苗木繁育技術[J].煙臺果樹, 2010 (2): 30-31.

[4] 沙廣利.蘋果無融合生殖矮化種質(zhì)創(chuàng)新[D].山東農(nóng)業(yè)大學, 2007.

[5] 沙廣利.無融合生殖蘋果砧木新類型-青砧1、2號[J]. 煙臺果樹, 2015(4): 21-22.

[6] 周瑞金,杜國強,師校欣.標記基因nptⅡ在轉(zhuǎn)基因蘋果嫁接砧穗間無相互傳導[J].園藝學報,2006, 33(6):1329-1330.

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[13] 李艷紅, 馮寶焜.蘋果砧木M26離體葉片愈傷組織發(fā)生及分類研究[J].果樹科學,1999,16(4) :259-262.

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2016-06-28

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊崗位專家項目(SDAIT-06-03)

葛紅娟(1985-)，女，山東聊城人，助理研究員，果樹資源育種及分子生物學研究。E-mail:ghj042@163.com

S661.1

A

1002-2910(2017)02-0008-03

*通訊作者：郝玉金(1971-)，男，山東章丘人，教授，從事果樹分子生物學與生物技術研究。