HBV逆轉錄酶區基因耐藥變異的研究現狀

李 健綜述，曾小平審校

(1、南昌大學基礎醫學院免疫學教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民醫院檢驗科，江西宜春336000)

HBV逆轉錄酶區基因耐藥變異的研究現狀

李 健1，2綜述，曾小平1審校

(1、南昌大學基礎醫學院免疫學教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民醫院檢驗科，江西宜春336000)

乙型肝炎病毒是最容易產生基因變異的病毒之一，不僅自然變異率較高，而且抗病毒藥物和免疫因素可誘導其產生適應性變異。乙型肝炎病毒逆轉錄酶區的基因變異可導致其對核苷（酸）類似物產生耐藥性。檢測乙型肝炎病毒逆轉錄酶區基因變異不但可以發現和研究新的耐藥變異位點，還可為臨床治療乙肝患者時選擇合適抗病毒藥物、耐藥監測、預后提供參考。但不同的檢測方法有各自的特點，可根據實際情況選擇合適的方法運用于臨床實踐或科學研究。

乙型肝炎病毒；HBV逆轉錄酶區；核苷（酸）類似物；耐藥變異

我國是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染高流行區域[1]，一般人群HBV表面抗原（HB-sAg）的攜帶率為7.18%；慢性HBV感染者約9300萬人，慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年死于HBV感染所致疾病50余萬人[2，3]。目前抗HBV藥物除干擾素外，另一類為核苷（酸）類似物（nucleoside analogues，NAs），主要包括：拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韋酯（Adefovirdipivoxil，ADV）、恩替卡韋（Entecavir，ENV）、替比夫定（Telbivudine，LdT）等。NAs其進入機體后，形成三磷酸活性成分與機體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競爭結合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA鏈合成終止，這是核苷（酸）類似物抑制HBV復制的機制[4]。NAs抗病毒療效顯著、副作用少、價格經濟，因而廣泛應用于臨床乙型病毒性肝炎抗病毒治療，但隨著用藥人群基數增大和用藥時間延長其耐藥問題逐漸凸顯。本文就HBV逆轉錄酶區基因變異與NAs耐藥的耐藥機制、變異位點、變異模式、耐藥變異的檢測等做一綜述。

1 HBV逆轉錄酶區基因變異導致核苷（酸）類似物耐藥的機制

乙型肝炎病毒發生基因變異特別是HBV逆轉錄酶區（也可稱P區、聚合酶區）的基因變異，導致產生的HBV聚合酶與核苷（酸）類似物結合力降低，那么變異的HBV即不受核苷（酸）類似物的抑制或抑制能力下降，因此，在繼續應用核苷（酸）類似物治療的情況下，野生株病毒因對核苷（酸）類似物敏感而繼續被抑制，變異株病毒因具備一定的復制能力，而且對核苷（酸）類似物不敏感而逐漸代替野生株，成為體內的優勢株，從而導致患者對于核苷（酸）類似物的耐藥[4]。耐藥變異的產生一方面是在分子結構上產生了影響HBV聚合酶表達的基因變異；另一方面耐藥變異株和野生株的共生生態的變化，耐藥變異株要能夠持續的復制增殖達到一定的數量水平成為所謂的優勢株，并表現出耐藥的臨床表現。然而目前并沒有足夠的研究明確優勢株在準種池的比例，再者不同的HBV基因變異檢測方法能檢出的變異株的敏感性也存在明顯的差異[5，6]，需要進一步研究HBV基因變異的未知位點和變異模式、變異株的拷貝數、變異株在準種池內的比例與耐藥的關系[7]。

1.1 HBV逆轉錄酶區基因變異的類型

1.1.1 自然變異乙肝病毒基因組（HBV-DNA）含有3200個核苷酸，其中HBV逆轉錄酶區有344個核苷酸，據統計HBV核苷酸錯配率約為10-5左右，HBV每天約可產生至少1012個病毒[8]，那么HBV逆轉錄酶區就可產生109的堿基錯配，如此高的自然變異是耐藥變異的基礎[9]。

1.1.2 選擇壓力下的適應變異HBV有很高的自然變異，變異隨著病毒不斷增殖而積累，在免疫因素和抗病毒藥物施加的選擇壓力下，不能適應選擇壓力的變異被抑制，能適應這些選擇壓力的變異株就有可能成為優勢株而導致耐藥的產生。

1.2 抗病毒藥物的效果影響耐藥變異株的產生HBV變異的積累依賴于乙肝病毒超強的復制和增殖，如果抗HBV藥物有很強的抗病毒能力而迅速抑制了病毒的復制，耐藥變異就很難產生。如果抗HBV藥物抗病毒能力很弱，就無法對病毒形成選擇壓力，那么適應藥物的耐藥變異也很難被篩選出來。中等抗病毒效果的藥物治療下既能形成選擇壓力又不能完全抑制病毒復制，最有利于耐藥變異株的產生。

1.3 影響HBV逆轉錄酶區基因耐藥變異的其它因素基因屏障是控制出現表型耐藥的耐藥基因變異的位點數目。高基因屏障藥物需要病毒出現多個位點的基因變異才可能出現耐藥，因而高基因屏障的耐藥率低，抗病毒藥物聯合用藥可以提高基因屏障[10]。HBV的復制空間是指肝臟中更新的肝細胞為cccDNA或新的復制模板提供的空間。正常肝細胞更新較慢，但肝臟在嚴重的炎癥損傷下肝細胞更新很快，耐藥變異株可以利用這些變異空間進行大量復制。另外影響乙肝患者臨床抗病毒藥物治療效果相關的因素如用藥史、依從性、遺傳、年齡等也間接與耐藥變異相關[11，12]。

2 HBV逆轉錄酶區常見NAs耐藥變異位點和變異模式

2.1 耐藥變異位點HBV逆轉錄酶區長度為344個氨基酸殘基，N端第1個氨基酸E(谷氨酸)為起點，以rt1－rt344來命名。目前已發現的HBV逆轉錄酶區耐藥變異位點有：L80V/I、V84M、S85A、L108M、L164V、I169T、V173L/M/I、L180M、A181T/V /S、T184G/A/I/S/M、L187I、I190V、A194N/T、V198L、A200V、S202I/G、M204V/L/S、L/M/V207I、S213T、Q214 A/E、Q215s、L217R、S219A、F221Y、rtA222T、A223S、L229V/W、I233V、1、N234T、N236T、N238H、M250V、S256C/G、T259A、D263E、L267Q、L269I、Q271E、P28 lL[13，14]。不同種類NAs耐藥與HBV逆轉錄酶區相關變異位點不盡相同。拉米夫定耐藥相關變異位點主要有rtM204I/V/S、rtL180M、rtV173L/M/I、rtL180M、rtA181T/V/S、rtI169T、rtQ215S等，以rtM204I/V最常見；阿德福韋酯耐藥相關變異位點主要有：rtN236T、rtA181S/T/V；恩替卡韋耐藥相關變異位點為rtI169T、rtL180M、rtT184S/A/I/L/F/G、rtS202I/G、rtM 204V、rtM250V，以rtTl84G/S/A/C位點變異常見；替比夫定耐藥變異有rtM204I、rtAl94T等[13－21]。

2.2 耐藥變異模式與拉米夫定耐藥相關常見的耐藥模式有rtM204I/V、rtM204V＋rtL180M、rtM204V＋rtL180M＋rtV173L[17，18]，拉米夫定耐藥相關突變中，rtM204V通常伴隨rtL180M，rtM204I多單獨出現[17]；阿德福韋酯耐藥相關常見的耐藥模式有rtA181T/V、rtN236T、rtA181T/V+rtN236T。NAs序貫治療容易發生基因耐藥變異且易發生多位點變異。檢測出多位點組合變異模式，往往提示可能出現多種NAs耐藥，如出現rtAl8lT/V+rtM204V/I變異模式，可導致對拉米夫定和阿德福韋酯均耐藥；當恩替卡韋與拉米夫定、阿德福韋酯存在交叉耐藥，變異模式有rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+rtM204V/I，rtLl80M+rtS202G/I+rtM204V/I，rtLl80M+rtM204V/I+ rtM250V，rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+rtM204V/I+ rtM250V，rtVl73L+rtM204V/I+rtM250V，rtVl73L+ rtLl80M+rtTl84G/S/A/C，rtLl80M+rtTl84G/S/A/C+ rtS202G/I+rtM204V/I，rtAl8lT/V+rtTl84G/S/A/C等[13－21]。

3 HBV逆轉錄酶區耐藥基因變異的檢測方法

3.1 運用DNA測序原理的檢測方法

3.1.1 直接測序法該方法對HBV全基因組測序，既可對已知的耐藥變異位點進行檢測，也可對未知的耐藥變異進行檢測研究。臨床上以檢測常見耐藥變異位點為主。本方法缺點是敏感性低，要求樣本的病毒載量＞104拷貝/ml且占總準種池≥20%的病毒變異株，因而不適用于早期檢測出耐藥變異的發生。有研究在直接測序基礎上發展克隆測序法，即通過克隆后再測序以克服直接測序法敏感性低的缺點，但分析大量的克隆樣本耗時費力且對技術要求高，不適合臨床篩查。有報道利用巢式PCR技術，提高直接測序法檢測的敏感性，在病毒載量只有500拷貝/ml的樣本檢測到了耐藥變異并且可以檢測到占準種池10%的耐藥株[22]。

3.1.2 焦磷酸測序法該方法的檢測通量比直接測序法高約100倍，可以對HBV基因組上的任意片段進行測序，在同時檢測多個已知的耐藥變異同時也可以檢測未知的耐藥變異。焦磷酸測序法不需要標記引物、核苷酸和凝膠電泳，具有高靈敏、高特異性和準確性等特點，能早期檢測核苷(酸)類似物治療患者的HBV逆轉錄酶區基因耐藥突變異，適用于慢性乙肝患者核苷(酸)類似物的治療監測，是目前已知的檢測HBV耐藥相關變異敏感性較高的方法[23]。

3.2 運用雜交原理的檢測方法

3.2.1 線性探針技術將特異的寡核苷酸探針固定于硝酸纖維素膜條上對生物素化PCR擴增的目標片段進行反向雜交后顯色，使檢測結果肉眼可見。本法對檢測樣本病毒載量的要求與直接測序法相近但檢測敏感性更高[24]。可檢測病毒載量＞104拷貝/ml且占總準種池≥5%的病毒變異株[25]，因而本方法適用于臨床上早期發現耐藥變異的出現。但本方法受探針的局限，只能檢測常見的幾種變異位點，不能用于檢測和研究未知的耐藥變異[26]。

3.2.2 熒光實時定量PCR該方法結合了PCR技術和FRET核酸定量檢測技術。在DNA擴增的同時釋放可供檢測的熒光信號，實現對模板DNA的定量分析。該方法應用于單核苷酸多態性分析，檢測的敏感性高，對血清樣本病毒載量要求較低。此法敏感性較高，可同時檢測多個耐藥變異位點。有報道表明本法可檢測當病毒載量＞105拷貝/ml時占總準種池≥1%的病毒變異株[27]，然而已知耐藥位點不斷增加，該法難已滿足臨床檢測的需要。

3.2.3 基因芯片法該方法在芯片表面有序地固定高密度的寡核苷酸或特定基因片段探針，再與生物素標記的待檢基因片段反應，然后通過顯色產生熒光信號，軟件處理信號獲得待測基因序列信息。該法具有高通量，操作簡單的特點，但價格高[28]。尚未廣泛運用于臨床，如能進一步降低成本，該法有極大的臨床應用前景。

3.3 表型耐藥檢測表型耐藥檢測是指在體外細胞培養系統中使HBV基因組中一個或多個位點突變，再檢測病毒對藥物的敏感性降低或喪失，可作為耐藥診斷的依據[29]。已發展多種技術如瞬時轉染細胞模型（transient transfection）、穩定轉染細胞模型（stable cell lines)、酶活性分析（enzymatic assay）等用于檢測表型耐藥。該技術在闡明耐藥機制、動態性耐藥監測、發現耐藥變異、篩選新型抗病毒藥物等方面都具有廣闊的前景。目前該技術逐漸從科學研究應用于臨床耐藥分析。

4 小結

目前，臨床已廣泛使用核苷（酸）類似物治療HBV感染，但具有極高變異能力的HBV的耐藥問題已逐漸凸顯[30]，甚至出現針對多種核苷（酸）類似物的耐藥性。耐藥的產生往往導致抗乙肝病毒治療的失敗，進而引起乙肝患者病情的反跳。適應藥物壓力的HBV逆轉錄酶區耐藥變異、核苷（酸）類似物抗病毒效果、基因屏障、HBV復制空間和一些宿主因素的共同作用導致了核苷（酸）類似物耐藥的產生。多種檢測方法可用于HBV逆轉錄酶區耐藥變異的變異位點、變異模式和表型耐藥檢測，并結合臨床以早期評估核苷（酸）類似物耐藥的產生、耐藥監測，為指導臨床合理選擇藥物、用藥方案和耐藥產生后藥物調整提供依據[31]。臨床仍需要更多研究來發現新的變異位點和進一步明確耐藥變異與臨床診斷、選擇抗病毒藥物、病情變化的關系。不同的檢測方法有各自的優點及局限性，還需要進一步研究高性價比、高通量、高敏感性特異性、操作簡單的篩檢HBV逆轉錄酶區耐藥變異的檢測方法。

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R512.6+3，Q523

A

1674-1129(2017)01-0064-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.019

2016-07-18；

2016-12-21)

李健，1983年生，學士學位，主管檢驗師，南昌大學基礎醫學院免疫學教研室同等學歷申請碩士學位研究生；研究方向：乙肝病毒基因耐藥變異。

曾小平，1973年生，副教授，碩士生導師。