保健食品毒理學與功能動物學試驗中應該注意的一些典型問題

國家食品藥品監(jiān)督管理總局保健食品審評中心（100070）蔡鐵全

北京市保健品化妝品技術(shù)審評中心（100053）劉彬 周立新

北京市藥品檢驗所（北京市保健食品化妝品檢驗中心）（100035）趙晉燕 胡宇馳 金鑫

隨著生活水平的提高和人們對自己健康狀況的重視，對保健食品的研究也不斷深入。本文總結(jié)了近年來進行保健食品毒理學試驗和功能驗證動物學試驗研究中出現(xiàn)的一些問題，希望從事保健食品研究與試驗的實驗室能夠互相借鑒，避免工作中的一些失誤。

1 試驗設計中的問題

1.1 劑量設計不合理 保健食品作為特殊食品一般來說相對安全，有些實驗室在進行毒理學試驗的時候未能充分考慮受試樣品的所有檢測試驗的要求。例如，急性毒性試驗僅僅是試驗劑量達到5g/kgBW，但受試樣品并不是最大的溶解度、最大的給予體積。遺傳毒性試驗因為需要達到試驗要求的10g/kgBW給予受試樣品，這樣就導致急性毒性試驗受試樣品的使用濃度和劑量均低于遺傳毒性試驗劑量。一般來說，急性毒性試驗必須采用最大溶解度和最大灌胃容積來進行MTD試驗，并應該盡量做到一日內(nèi)給予劑量不小于10g/kgBW。

30天喂養(yǎng)試驗設計時，應該想辦法使高劑量達到人用劑量的100倍或100倍以上；如果成品添加到飼料中也不能達到100倍以上時，應該適當減少輔料或者直接采用原料來進行試驗，從而盡量達到符合要求的安全倍數(shù)的要求。如果是液體受試樣品，必須采用適當?shù)姆椒ㄌ岣邉┝浚ㄈ鐫饪s受試樣品），以保證30天喂養(yǎng)試驗的給予倍數(shù)達到100倍以上。進行喂養(yǎng)試驗時，當受試樣品的摻入量高于5%時，應添加酪蛋白，并應該說明酪蛋白添加量的計算過程。劑量設計中，如果需要去掉受試樣品中含有的某種成分時，去除后給予受試樣品的劑量和人體實際使用劑量之間的折算關(guān)系也應有計算說明，應合理設計。

1.2 測定指標不合理 主要是指標嚴重缺失。例如急性毒性試驗中未測定給予受試樣品后動物的體重變化；精子畸形試驗中觀察“尾折疊”時，沒有詳細說明判定標準；30天喂養(yǎng)試驗中未按要求測定體重、攝食量、食物利用率、臟器重量，測定的血液學、血清生化學指標有缺項；受試樣品具有某些功效，但是在毒性試驗中未觀察到相關(guān)的改變。（如具有促進排便功效的樣品，在進行急性毒性試驗及30天喂養(yǎng)試驗的時候未觀察動物排便情況。）

1.3 對照品選擇不合理 Ames試驗中陽性誘變劑的選擇不合理（如在進行+S9試驗時，TA102的陽性對照不應選擇順鉑，而應選擇1，8-二羥基蒽醌）；受試樣品配制使用溶媒和陰性對照組給予的受試物不一致（如受試樣品使用蒸餾水配制，卻以植物油作為陰性對照組）；當受試樣品中含有酒基的時候，未設定酒基對照組；Ames試驗兩次試驗不能共用一個陽性對照組，每次試驗均應設定陽性對照組。

1.4 受試物的處理不合理 樣品處理時不能保證樣品的穩(wěn)定性：當受試樣品中含有維生素E或者魚油時，試驗采用摻入法給予動物，不能合理解釋如何保證所含的維生素E不被氧化或魚油在摻入飼料后還能具有良好的穩(wěn)定性。

溶媒選擇不合理：如非水溶性的受試物選擇蒸餾水溶解，含有蜂膠、大豆油、卵磷脂成分的樣品采用蒸餾水溶解是不妥當?shù)模徊煌囼灢捎貌煌娜苊竭M行受試樣品的稀釋，例如：某一受試樣品，急性毒性試驗、精子畸變試驗及微核試驗用2%淀粉溶液做溶媒，而Ames試驗、30天喂養(yǎng)試驗用蒸餾水做溶媒。實際上，設計中應注意同一受試樣品的毒理學、功能學試驗的溶媒應相同。

樣品預處理不合理：無菌試驗的受試樣品未滅菌即行試驗；滅菌操作方法未進行詳細說明，如采用高壓滅菌時未注明滅菌的溫度、時間。采用過濾滅菌時未說明采用何種濾膜，孔徑。滅菌方法不合理（如受試樣品中含有不耐熱的活性物質(zhì)，卻采用高壓滅菌的方法除菌或者是采用非常規(guī)的的滅菌條件未能說明使用該條件的理由）；Ames試驗中采用的受試樣品含有組氨酸或者是糖類、其他氨基酸類的成分，當這類成分能夠影響結(jié)果的判斷時，在試驗時未除去影響的成分或者是處理的過程、方法沒有詳細的描述；Ames試驗的受試樣品中組氨酸的含量較低，不會誘發(fā)回復突變頻率增高，試驗前去除組氨酸卻沒有說明去除的理由；30天喂養(yǎng)試驗時候使用去除輔料的受試樣品，未說明去除輔料的方法或者是去除輔料樣品的來源；乙醇含量超15%時，未將乙醇含量降低到15%。

2 試驗過程中的問題

2.1 試驗結(jié)果的處理不合理 試驗結(jié)果未選擇適當?shù)慕y(tǒng)計方法進行統(tǒng)計學處理：主要有各受試樣品組的參比組錯誤（應與陰性對照組/空白對照組進行比較）；當受試樣品組與陰性對照組（空白對照組）進行比較，差異具有顯著性意義的時候未進行標注，也未進行相關(guān)的分析說明；試驗結(jié)果中的每一項具有顯著性差異的檢測指標未逐一標注并說明。例如：30天喂養(yǎng)試驗中某次測定的食物利用率低于其他測定值，未進行相應的說明；血清生化學測定指標、血液學測定指標中的某項指標低于或高于對照組，未說明原因。

2.2 未注意試驗數(shù)據(jù)與背景數(shù)據(jù)比較 每個實驗室均應有自己的相關(guān)背景數(shù)據(jù)積累，如正常動物微核的千分率，正常小鼠精子畸形的種類及發(fā)生率。試驗得到的數(shù)據(jù)應注意與背景數(shù)據(jù)的比較，科學分析試驗結(jié)果與試驗數(shù)據(jù)的毒理學意義。

例如Amse試驗中：陰性對照自發(fā)回變率超出參考值未說明原因；陽性對照的自發(fā)回變率、精子畸形試驗和微核試驗的陽性對照組的精子畸形率、微核率低于文獻報道時，沒有相關(guān)分析；當試驗結(jié)果超出一般的范圍時，未結(jié)合本實驗室的背景數(shù)據(jù)進行分析。

30天喂養(yǎng)試驗中測定的血液學、血清生化學指標受試樣品組與對照組的檢測指標有差異時，未進行分析，未提供本實驗室的背景數(shù)據(jù)及測定的質(zhì)控數(shù)據(jù)。

組織病理學檢查中發(fā)現(xiàn)某種病理改變在多只動物身上發(fā)生，沒有分析說明該種病變發(fā)生的原因（如是否為動物的自發(fā)病變，是否與受試樣品有關(guān)）；當組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)病變時，在病理檢查報告中沒有詳細說明病變的種類，病變發(fā)生的數(shù)量，發(fā)生病變的動物的性別。

2.3 試驗中原始記錄不詳細 試驗的原始記錄應當用簽字筆手寫或填寫表格中有關(guān)內(nèi)容，必須做到真實、及時、準確和完整，并規(guī)范化和表格化。原始記錄不能只包括數(shù)據(jù)收集，還要證明所有程序都是按照要求在正確的時間正確實施，做到規(guī)范記錄，不得漏記和隨意涂改，不得偽造、編造數(shù)據(jù)。如果數(shù)據(jù)缺失或沒有完整的試驗記錄，試驗的正確性將受到質(zhì)疑。例如使用的材料信息不全：生化試劑盒缺乏使用說明書，不記錄生化試劑的批號、來源等，不記錄陽性對照物的批號、來源等。特殊管理的試劑，沒有按照國家規(guī)定進行管理，例如麻醉藥品、遺傳毒性試驗使用的陽性對照品沒有出入庫記錄，沒有配制、使用與廢棄記錄等。有的試驗，實際結(jié)果是由儀器記錄生成的數(shù)據(jù)，結(jié)果儀器中缺乏原始文件，只有手寫的數(shù)據(jù)記錄。

2.4 試驗中使用材料不符合規(guī)范要求 例如實驗動物的體重不符合試驗要求、實驗動物的級別不符合要求。

3 試驗報告中的問題

3.1 未注意全文的前后一致性 全文的內(nèi)容描述前后不一致或使用單位符號不統(tǒng)一。例如：毒理學報告中要求應表示為mg/kgBW或ml/kgBW，但報告中的實際樣品濃度及給予劑量與設計樣品濃度及給予劑量不一致（原始資料中設計劑量為10g/kgBW，檢查報告中為8g/kgBW），或者檢查報告中前后描述不一致（方法部分描述的劑量為10g/kgBW，結(jié)論部分變?yōu)?g/kgBW），或者報告中與原始記錄不一致（原始記錄中記錄為mg/kgBW，但報告中為ml/kgBW）。

3.2 報告結(jié)果不規(guī)范 例如表格中數(shù)據(jù)的表示不符合要求：檢驗報告表格中的數(shù)據(jù)一般以均值±標準差表示。精子畸形試驗、微核試驗結(jié)果中，畸形率、微核率、PCE/RBC（PEC/NCE）不是以均值±標準差表示的，且精子畸形試驗結(jié)果未列明畸形的類型；用詞用語不規(guī)范：報告中判定結(jié)論“無毒物”規(guī)范為“無毒級”。

3.3 報告結(jié)果的不完整 包括未提供相關(guān)材料信息：如未提供與實驗動物相關(guān)的材料（動物合格證號、生產(chǎn)許可證號、使用許可證號）。當要求使用特定級別、性別、體重的動物時，試驗報告中未進行說明。關(guān)鍵的試驗方法應進行說明，以保證能夠重現(xiàn)試驗。例如受試物的配制方法在報告中應進行簡明扼要的敘述，但有的報告中配制的方法不明確，無稱量體積，無加入溶媒的量，最終濃度等配制方法的描述。

3.4 報告的真實性存在質(zhì)疑 如某受試樣品的受理日期為2008年3月18日，毒理學試驗報告簽發(fā)日期為2006年3月11日，動物功能試驗報告簽發(fā)日期為2006年1月10日，功能試驗報告及毒理學試驗報告的簽發(fā)日期遠遠早于受試樣品的受理日期。

4 小結(jié)

綜上所述，在目前巨大的市場需求的前提下，各實驗室應該努力提高本單位的試驗水平，同時認真解讀所使用的檢測標準，本著嚴謹、科學的態(tài)度完成檢測試驗，出具檢測報告。