微生物降解低階煤的研究及產物腐植酸的應用

王若楠 邱小倩 劉 亮 袁紅莉 陳文新

(中國農業大學生物學院 北京 100193)

微生物降解低階煤的研究及產物腐植酸的應用

王若楠 邱小倩 劉 亮 袁紅莉*陳文新

(中國農業大學生物學院 北京 100193)

腐植酸的合理施用是實現農業減施化肥目標的重要措施，是對國家新時代綠色化發展號召的積極響應。煤炭是植物殘體在一定的地質條件下經過微生物的分解轉化形成。低階煤由于其煤化程度低、灰分及含水量高，容易被微生物降解轉化形成水溶性腐植酸類產物。本文從腐植酸資源及其重要性、目前已報道的能降解褐煤的微生物資源、微生物降解褐煤的機理及降解產物腐植酸的應用等方面進行了詳細的論述，并提出今后低階煤微生物轉化的研究和發展方向，以期為利用生物技術降解轉化礦源腐植酸的研究及產品開發應用提供參考。

腐植酸 褐煤 微生物降解 黃腐酸

腐植酸是動植物殘體(主要是植物殘體)在復雜的地質環境下經過微生物的分解和轉化，以及一系列的化學過程而積累起來的一類有機物質[1]，廣泛存在于土壤、水體以及泥炭、褐煤、風化煤中。腐植酸具有獨特的結構和理化性能，其作用涉及到地球化學循環的各個方面。腐植酸肥料已作為一種功能性肥料廣泛應用于農業生產，它可以增強土壤活力、促進植物生長、增強植物根系活力、提高植物抗逆性、提高肥料利用率、減少肥料使用量，與國家十九大中“綠水青山就是金山銀山、綠色發展、環境問題、生態系統保護”的發展理念相吻合，符合綠色化發展的新時代政策，符合現代農業可持續發展的要求。目前主要的兩大類腐植酸是礦源腐植酸和生物腐植酸。生物腐植酸一般是以工農業有機廢棄物為原料，經微生物發酵而成的腐植酸；礦源腐植酸主要是指存在于泥炭、褐煤及風化煤等礦產資源中的腐植酸，也是目前市場上腐植酸產品的主要來源[2]。

我國礦源腐植酸資源豐富，儲量大且分布廣。據統計，有泥炭124．8億噸，居世界第4位；褐煤1303億噸，還有大量的風化煤約1000億噸[3]。這些低階煤含大量的原生腐植酸，因其煤化程度低，稠環結構少，脂肪鏈狀結構多，含有更多類木質素結構，結構更趨近于原始植物殘體，使其易于被微生物降解。大量研究表明，相比于物理化學法，利用微生物降解煤生產腐植酸的技術具有能耗低、轉化條件溫和、轉化效率高、污染小、能實現資源的可持續化利用、轉化產物的整體經濟效益和應用價值高等優點[4，5]。泥炭因結構簡單最易降解，但可開發的資源有限。除泥炭外，褐煤是最易降解且儲量豐富的低階煤，目前國內外生產腐植酸多以褐煤為主要原料。下面就以褐煤為例從降解菌種類、降解機制、產物腐植酸的特點和應用方面綜述微生物降解低階煤的研究進展，并對未來的發展趨勢進行展望。

1 褐煤的生物轉化

褐煤是煤化程度較低的煤種，具有芳香環縮合度小，側鏈、橋鍵及活性官能團含量高的特點，且含有類木質素結構的物質，使其易于被微生物分解轉化[6]。早在20世紀80年代Fakoussa和Cohen等[7，8]就發現假單胞菌和白腐菌可以降解褐煤，開啟了煤炭加工新領域，尤其在利用微生物降解褐煤等低階煤產生腐植酸/黃腐酸方面引起了研究者的極大關注。在之后的幾十年里，通過不懈的努力，豐富了煤炭生物轉化的菌種資源，揭示其降解機制，同時不斷開發降解產品且拓展其應用，從而加速了煤炭的轉化和清潔利用。

2 褐煤降解轉化的微生物資源

迄今為止發現的能降解煤的微生物主要有細菌、真菌和放線菌。放線菌報道相對少，主要有Streptomyces viridosporus T7A、Streptomyces setonii 75Vi2、Streptomyces badius、Streptomyces flavovirens、Actinosynnema sp．和Nocardia sp．等[9，10]。繼Fakoussa發現褐煤降解細菌惡臭假單胞菌Pseudomonas putida后，又發現一些芽孢桿菌，如Bacillus subtilis、Bacillus pumilus、Bacillu scereus也具有降解能力。此外，還有節細菌屬Arthrobacter sp．，多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa，球紅假單胞菌Rhodopseudomonas spheroids[11，12]。真菌是降解煤的主要微生物，報道最多的是擔子菌中的Phanerochaete chrysosporium[13]。其他真菌有Trametes versicolor、Polyporus versicolor、Poria placenta、Coriouls versicolor、Paecilomyces Tli、Penicillium、Mucor、Aspergillus terricola、Aspergillus ochraceus、Cunning hamella sp．、Pleurotus florida、Pleurotus ostreatus、Pleurotus caju、Pleurotus eryngii、Trichoderm aviride、Stropharia sp．、Fusarium oxysporum、Ascomycota Hypocrea lixii[14]、Laetiporus sulphureus[15]、Golden Mushroom[16]、 酵母Canadida sp．也具有降解煤的能力。

除了傳統的分離培養方法篩選褐煤降解微生物，也有研究者通過誘變育種和基因工程等方式來獲得高效褐煤降解菌，如Yuan等[17]通過對一株褐煤降解力強的Penicillium sp． P6進行紫外及亞硝基胍誘變，明顯提高了該菌的降解能力；徐敬堯等[18]通過對黃孢原毛平革菌進行原生質體紫外誘變選育，獲得了高效的煤炭生物降解轉化菌株。

自然環境中物質的降解是由多種微生物協同完成的，單一菌種不足以完全降解褐煤。因此從20世紀80年代開始，人們研究不同微生物間的協同降解作用，逐步形成了混合培養技術。但是目前的混合培養技術主要是利用純培養的菌株組合，而自然界中許多高效降解微生物無法通過純培養得到，因此直接從自然界篩選獲得菌群是近年來研究的熱點。Maka等[19]從褐煤中分離到2個低階煤降解菌群，經鑒定發現主要組成為：細菌Bacillus subtilis、Bacillus pumilus、Bacillus scereus和真菌Aspergillus sp．，但褐煤降解率低，添加未經化學法處理的褐煤，2個菌群在培養25天后，降解產物在425 nm處吸光值低于0．2；而Gao等[20]從低階煤儲量豐富的地區采集樣品，篩選到3組高效降解菌群，其中菌群MCSL-2含有2類細菌Bacillus lichenoformis和uncultured Stenotrophomonas，對未經處理的新疆風化煤降解25天后，產物在腐植酸特征吸收峰450 nm處吸光值高達30，經過41天培養幾乎可以全部降解，且降解產物具有明顯的生物活性，推測這種高效降解可能是因為不同降解菌分泌的降解酶系間的互補作用。

雖然已報道的褐煤降解微生物種類繁多，但是大量的研究證明，同一降解菌對不同的低階煤降解效果差異很大，因此針對具體的褐煤資源選育相應的高效降解菌株或菌群將是今后工作的一個重要方向。

3 微生物降解褐煤的機理

基于大量的實驗結果，研究者們提出微生物可能主要通過分泌到細胞外的堿性物質、螯合劑和表面活性劑、生物酶等對褐煤進行降解。

3.1 堿性物質

Quigley等[9]首次發現微生物可通過分泌氨、生物胺、多肽及其衍生物等堿性物質使褐煤發生脫質子化，形成黑色液體。1988年Strandberg等[10]發現Streptomyces setonii 75Vi2可分泌一種對蛋白酶不敏感的小分子活性物質來促進煤溶解，進一步證實了該結論。后續研究發現，培養液的pH越高，煤的溶解量就會越高，而培養液pH的高低與其中多肽或多胺的含量有關[21]。Jiang等[22]發現具有較高褐煤降解能力的Bacillus sp． Y7會產生一種堿性物質降解褐煤，該物質耐高溫且對蛋白酶不敏感，具有蛋白類似結構，其含有的νN-H、νC=O和δN-H是與褐煤降解相關的主要功能基團。Gao等[20]也發現菌群MCSL-2降解風化煤的主要因素是產生了堿性物質。

3.2 螯合劑和表面活性劑

褐煤大分子結構中含有由多價陽離子形成的鹽橋，微生物生長過程中產生的螯合劑與煤中的金屬離子結合，導致煤大分子結構瓦解，從而實現煤的降解。1990年，Cohen和Feldmann[23]首次發現Trametes versicolor產生的螯合劑草酸胺參與了褐煤液化過程。Ralph[24]證實去除金屬離子后，褐煤的分子量明顯降低，進一步從側面說明了螯合劑在微生物破壞褐煤結構上的作用。

表面活性劑可以在不需要打斷煤共價鍵的情況下促進許多極性物質的溶解，幫助微生物降解褐煤。但是由于其不能打斷共價鍵，使得其單一作用時效果不佳[25]，所以表面活性劑主要通過提高相關降解酶的吸附來促進褐煤的降解。Yin等[26]發現表面活性劑可以通過增加煤表面的親水性，促進酶的吸附使其更好地發揮作用。Yuan等[17]發現Penicillium decumbens除產生堿性物質外也可分泌表面活性劑類物質溶解褐煤。

3.3 生物酶

褐煤含有類木質素結構，堿及螯合劑和表面活性劑增加了煤的溶解性，增溶后的解聚作用需要生物酶，尤其是木質素降解酶的參與[27]，其可以打斷煤分子的共價鍵，從根本上將大分子結構降解，在腐植酸的解聚中起決定性作用。褐煤降解酶主要可以分為氧化酶和非氧化酶類[28]。氧化酶包括木素過氧化物酶(Lignin peroxidase，LiP)，錳過氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)，非氧化酶主要為酯酶[29]，目前對氧化酶的研究較為深入。

3.3.1 木素過氧化物酶(LiP)

木素過氧化物酶是一類糖基化亞鐵血紅素蛋白酶，是唯一能直接氧化富含電子的非酚型芳香化合物的酶[30]。其對木質素的降解需要H2O2的參與，具體步驟為LiP首先與H2O2反應生成復合物I，然后復合物I失去一個電子形成復合物Ⅱ，最后回到含Fe(III)的原始酶狀態，這樣酶催化循環得以維持。1989年Wondrack等[31]發現Phanerochaete chrysosporium產生的LiP經初步純化后可以部分降解硝酸處理的褐煤和德國次煙煤中的煤炭聚合物。隨著研究的深入，還發現LiP可以對褐煤和被甲基化的堿溶性褐煤進行脫色和解聚[32]。Yadav等[33，34]從Gloeophyllum sepiarium MTCC-1170和Lenzitus betulina MTCC-1183的培養液中純化到的LiP可以在H2O2存在的情況下降解褐煤。楊金水等[35]發現褐煤降解菌Penicillium decumbens P6會分泌LiP來降解褐煤。

3.3.2 錳過氧化物酶(MnP)

MnP的酶促反應循環與LiP相似，包括原始酶、復合物I、復合物II的氧化還原狀態。但是與LiP不同的是MnP的還原反應需要Mn的參與，Mn2+將復合物I和復合物II還原，自身被氧化成Mn3+。MnP最大的優勢在于它的催化反應是通過氧化還原中間體Mn(II)/Mn(III)進行，它們可以在解聚反應中再生。同時，由于它們足夠小可以很容易地進入煤顆粒，而其他相對較大的酶分子卻不能直接進入煤顆粒對煤進行降解。

Hofrichter[36]首次發現Nematoloma frowardii b19的MnP粗提液可以將褐煤腐植酸類物質解聚形成低分子量的黃腐酸，進一步利用MnP解聚14C標記的腐植酸類物質，發現腐植酸類物質轉化為小分子量的黃腐酸的同時，有相當的14CO2釋放，證明MnP能直接降解腐植酸[37]。姜峰[38]發現Pseudomonas sp． G6產生的MnP可降解褐煤釋放水溶性腐植酸，進一步將高分子量的腐植酸轉化成低分子量的黃腐酸；Gao等[20]發現菌群MCSL-2對褐煤的降解也有MnP參與。

3.3.3 漆酶(Laccase)

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，能夠非特異性催化多種芳香族化合物的氧化，同時將O2還原成水[39]。漆酶的催化中心包含4個順磁性的Cu2+，作用于酚、醛芳烴形成苯氧自由基，然后經過非酶催化反應，如自由基之間的聚合、歧化、水的親核攻擊等，最終導致烷基-苯基鍵的斷裂、Cα氧化或酚的去甲基化等[40]。

Cohen[41]于1987年首次提出漆酶是使褐煤降解的原因之一。之后有許多關于漆酶在褐煤降解中發揮作用的研究。褐煤來源的腐植酸可以誘導Bjerkandera adusta R59產生大量的漆酶[42]；Neosartorya fischeri ECCN 84可以產生氧化酶尤其是漆酶來降解褐煤供自身生長[43]；Wang等[44]從低階煤中分離到許多木質素降解菌，并從菌中擴增出漆酶類多銅氧化酶基因，均說明漆酶在褐煤降解中的作用。

3.3.4 酯酶

除了氧化酶，酯酶在褐煤降解中也發揮一定的作用。有研究表明，Trametes versicolor產生的酯酶和金屬螯合劑等對褐煤降解的貢獻比漆酶更大[23]。H?lker等發現14C標記的褐煤經過酯酶降解后，檢測到其中的酯鍵發生斷裂，表明酯酶可以降解褐煤[45]。馮建敏[46]對具有降解液化褐煤能力的2株真菌胞外酶活力進行檢測，發現均表現出高酯酶活性，且純化后的酯酶可以液化褐煤，證明酯酶在褐煤液化中確實起到了重要作用。但酯酶分子較大，難以進入致密的煤分子結構中，且其催化過程沒有小分子物質作為介質，直接導致酯酶作用的空間障礙，所以酯酶的作用機理還需要進一步研究[45]。

1981年，Fakoussa等[7]就發現褐煤降解有微生物產生的酶、堿性物質、表面活性劑及螯合劑的作用，隨后Yuan等[17]也發現斜臥青霉Penicillium decumbens P6能同時分泌堿性物質、表面活性劑和胞外酶來高效降解褐煤。Ghani等[25]表明煤降解機制涉及到氧化及非氧化酶、螯合劑、表面活性劑及堿性物質。由此可見，微生物對褐煤的降解是單一機理為主，還是多種機理共同作用，還需要做針對性的研究。

4 微生物降解褐煤技術及降解產物——腐植酸的應用

褐煤經過微生物降解作用后，可以釋放其中的腐植酸，并在降解酶的作用下進一步將大分子腐植酸解聚成分子量更小的物質如黃腐酸。腐植酸含有多種活性官能團，雖然已經廣泛應用于農業、畜牧業、工業和醫藥行業[47]，但主要是礦源腐植酸，經微生物轉化褐煤得到的腐植酸的應用報道很少。吳秀珍等[48]在玉米和白菜田間試驗區施用真菌降解褐煤的產物，發現對玉米和白菜有明顯的增產作用，可部分改善作物品質和土壤性質；柳麗芬等[49]的試驗結果也表明煤微生物轉化產物可以使白菜增重高達對照的6倍。以上研究表明，微生物轉化褐煤的產物具有土壤調節劑及植物生長刺激素的應用潛力。張明旭等[50]用煤微生物轉化的水溶性液態產物作添加劑制備水煤漿，與添加1%萘系添加劑的水煤漿相比，其各項指標都較優，價格也與萘系添加劑差不多，暗示其在工業生產中的利用價值。楊鑫[51]發現微生物降解褐煤得到的黃腐酸對二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹有抑制作用，即具有抗氧化性和抗炎性，說明其可以應用于醫藥行業。

袁紅莉等[52]從1987年開始了微生物降解褐煤生產黃腐酸及高活性腐植酸的系統研究，經過30年的持續努力，篩選出一批針對我國不同產地褐煤的高效降解菌，建立了利用組合菌進行階段發酵降解褐煤生產腐植酸的工藝技術流程，該技術不使用任何化學試劑，產品多元化而且無廢棄物，實現了資源的全利用。對降解獲得的腐植酸類物質的特性進行了詳細研究，發現產物分子量變小、含氮量增加、生物活性更高[53]。在多年的田間應用示范工作中，發現該黃腐酸噴施或拌種可以顯著增加多種作物(西紅柿、黃瓜、西瓜、甜葉菊、玉米、大豆)的產量并改善品質，如提高西紅柿中Vc及糖含量；通過調節甜葉菊糖合成基因及其內生菌群落組成，明顯提高甜葉菊甜菊糖產量，同時顯著提高萊鮑迪苷A在總糖中的含量，改善甜菊糖口感，為甜葉菊糖苷作為食品添加劑的推廣應用提供了重要的技術基礎[54]。在河北、河南、山東多地的大豆種植試驗中發現，通過噴施或根灌500 ppm的黃腐酸能顯著提高大豆結瘤率和固氮酶的活性，促進大豆生長，并使大豆產量提高12．6%～26．3%。進一步采用蛋白組學手段研究發現，黃腐酸可以加快大豆根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense CCBAU 05525)的代謝和營養的攝入，提高大豆根瘤菌的細胞密度以及誘導根瘤菌nod基因的表達，最終能夠促進大豆的結瘤和固氮酶活[55，56]。

近30年來，我國化肥用量逐年攀升，雖然化肥的使用保證了農業的高產和穩定發展，但我國單位作物播種面積平均施用量已達到國際公認化肥施用安全上限的1．61倍[57]。尋求農業綠色化生產方式已成為我國農業發展的重中之重。在減少化肥用量的前提下，開發并利用腐植酸類多功能且環境友好的新型肥料將成為提高農作物產量和品質的關鍵[58，59]。目前，國內外大公司紛紛開始關注腐植酸類植物生長調節劑的研發，微生物降解褐煤生產腐植酸技術具有極大優勢，該技術符合可持續發展理念，且我國褐煤資源儲量巨大，不僅實現了褐煤資源的有效利用，增加其附加值，而且從農業可持續發展角度上助力實現“土肥和諧”。

5 展望

低階煤微生物降解轉化技術，實現了低階煤資源的高效利用，降解產物也廣泛應用于各個領域，前景十分廣闊，但是仍然需要進一步優化來提高效率。優化低階煤的微生物降解轉化可以從以下3個方面展開工作：(1) 選育降解效果顯著、適應性廣的菌株(菌群)：可以通過傳統的分離篩選方法，及新型的誘變育種和基因工程手段獲得優質菌種；(2) 降解機制的進一步完善：隨著分析技術和手段的不斷發展，復雜的煤結構能夠進一步被解析，加速菌-煤之間的相互作用機制的研究，促進降解轉化過程；(3) 降解產物的獲得、分析及應用拓展：目前微生物降解褐煤的產物純化及分析技術仍不完備，相應技術的不斷更新，有利于產物的分析，進而開發更有價值的產物。

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Research on Microbial Degradation of Low-rank Coal and Application of Biodegradation Product Humic Acid

Wang Ruonan, Qiu Xiaoqian, Liu Liang, Yuan Hongli*, Chen Wenxin
(College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing, 100193)

The reasonable application of humic acid is an important way to achieve the goal of decreasing chemical fertilizer in agriculture. It is a positive response for the new era of national green development called. Coals are formed by plant residues which undergo the decomposition and transformation by microorganisms under the certain geological conditions. The low-rank coals, characterized with low degree of coalif i cation and high content of ash and water, were easy to be transformed into soluble humic acid by microorganisms. This paper discussed the resources and signif i cances of humic acid, microbial resources and mechanisms of lignite degradation, and the application of humic acid in detail.Furthermore, the research and development trends of the microbial conversion of low-rank coals were prospected to provide references for the application of microbial degradation of lignite and the exploitation of mineral humic acid.

humic acid; lignite; microbial degradation; fulvic acid

TQ314.1，Q939.99

1671-9212(2017)06-0003-07

A

10.19451/j.cnki.issn1671-9212.2017.06.001

2017-06-05

王若楠，女，1992生，在讀博士研究生，主要研究方向為環境微生物。*通訊作者：袁紅莉，女，教授/博士生導師，E-mail：hongliyuan@gmail.com。