犬在高原低氧環境適應性的研究進展

李 靜 陳方良 陳 超 萬九生 唐樹生 韋云芳

（公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204）

犬在高原低氧環境適應性的研究進展

李 靜 陳方良*陳 超*萬九生 唐樹生 韋云芳

（公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204）

高原環境中的低氧因素對于棲居在高原上的人類和動物是最極端的生存挑戰之一。犬在高原低氧環境下會產生一系列適應性的生理性變化，同時，低氧適應相關基因在機體低氧適應的調控過程中起著非常重要的作用。隨著分子生物學技術的發展，越來越多參與低氧適應調控通路的基因被發現。本文就犬在低氧適應性方面的生理變化和相關基因遺傳機制的研究進展進行綜述。目前犬表現出與低氧適應相關的基因大多涉及低氧誘導信號通路以及血紅蛋白血氧結合的通路上。開展低氧適應性研究可以為低氧相關疾病的研究提供生理和遺傳基礎資料，尋找低氧分子標進行高原耐低氧環境的定向品種培育，同時對高原家養動物特色基因的保存和利用及高原畜牧業的發展具有重要意義。

犬；高原低氧；EPAS1；HBB；適應性

1 前言

家犬作為人類最早馴化的家養動物和最親密的朋友，在人類進化遷徙的各個時期，家犬也跟隨人類遷徙到高原地區并已長期適應了高原的低氧環境。相比于低海拔地區的犬，高海拔地區的家犬在長期生活和適應積累的過程中，形成了特異的高海拔低氧適應性。研究犬在高海拔低氧適應性有多方面的重要意義，探求犬在高原地區適應性的生理機制，對警犬等用在高原地區出現的高原反應和疾病的防治具有重要作用。同時尋找低氧適應性相關的分子標記，可以定向培育適應高原環境的犬服務人類和警用等需要。本綜述旨在總結已有研究經驗，為下一步的犬高原適應性研究打下基礎。

2 高原地區的環境特征

高原通常意義上認為是海拔2000～3000m以上地域面積較為廣闊的特殊區域。對于生存在高原環境下的生命的影響涉及大氣物理，地球化學和生物生態環境等諸多方面，而低氧，低氣壓，低溫，強紫外線照射，大風、低濕度和氣候多變，這些都對生物的生存帶來了極大的挑戰。其中升高的海拔環境形成大氣壓下降和其中氧分壓的降低，可吸入氧含量的下降是對生命影響最主要的環境因素。研究顯示，當海拔上升到4000m時，空氣中氧含量僅為海平面的60%；而到海拔5000m時空氣中氧含量僅為海平面的50%甚至更低，因此氧分壓與海拔高度呈現出顯著的負相關[1]。

3 高原低氧環境引起的主要的生理變化

高原反應其本質是機體的低氧反應。以人類為例，未經適應的人迅速進入高海拔地區，由于空氣中的氧含量低下，導致吸入的空氣氧分壓降低，從而引發人體低氧血癥，俗稱“低氧”，也就是人們常說的“高原反應”。低氧適應的本質，就是在低氧的條件下，機體能夠最大化的利用有限的氧，進而完成正常的生理生化功能。生活在低海拔地區的人快速來到高原地區，對于輕度和中度低氧，在短暫適應一段時間后，機體通過整體水平代償機制調節，加快呼吸，增加肺通氣；通過增加紅細胞數目和血紅蛋白濃度，以增加攜氧能力保證氧氣供應；或加快心跳速率和加強心臟泵血功能，以增加血氧量等。這些適應性的變化可以達到短期低氧適應的目的。

然而對于更高海拔的重度低氧，整體代償作用則遠遠不能滿足機體對能量的需求。雖然人體受低氧環境的脅迫會加速產生血紅蛋白以獲得更多氧氣，然而血紅蛋白的過度生產卻又會導致血液黏稠。因組織細胞不能充分獲得氧和利用氧，使糖和脂肪不能徹底分解氧化，或堿中毒或酸中毒導致血糖升高、血壓或血脂升高；能量減少，不能滿足細胞組織需求，造成慢性高原疾病，甚至有可能引發肺水腫和腦水腫，導致呼吸困難、嘔吐等癥狀，嚴重時甚至出現猝死。除因環境缺氧外，還有精神緊張、勞累等使耗氧量增加，加重缺氧有關，但是關鍵還是組織細胞主動獲取氧和利用氧能力降低。

4 犬在高原低氧環境下機體生理適應性的變化

4.1 對心血管系統的影響

由于缺氧，犬的情緒興奮和輕微運動都會使心跳加速。初到高原，犬體的晨脈（清晨初醒時的脈搏）較海平面水平高20%左右。10d后，晨脈應降至原來水平[2]。所以，通過測量晨脈的變化程度和恢復到原有水平的時間，可以判斷犬對高原的適應能力。

紅細胞和血紅蛋白在生物體內負責運輸氧氣，滿足機體對氧氣的需要。而紅細胞在數量增多的情況下，紅細胞體積的減小會降低血液的黏滯性，進而不影響血液的流動速度，保證機體氧氣的運輸。高原動物在長期適應低氧環境的過程中，其紅細胞和血紅蛋白存在不同的適應特征。如鼠兔[3]、駝類及斑頭雁、安第斯雁，這些高原動物均以低血紅蛋白濃度（Hb）、低紅細胞壓積（Hct）提供高氧親和力。而野牦牛、家牦牛、藏綿羊和藏山羊的血液具有較高的紅細胞數（RBC）和血紅蛋白濃度（Hb）[4]。在對藏豬的研究中也發現，與普通豬相比，其平均紅細胞體積（MCV）和平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）均偏低[5]。

已有研究經過檢測了來源于青藏高原地區的藏犬以及中國大陸低海拔地區家犬的血紅蛋白濃度，發現高海拔藏犬群體與低海拔家犬群體的平均血紅蛋白濃度并無顯著差異[6]。

4.2 對呼吸系統的影響

由于氧氣壓力較低，犬會因缺氧而過度換氣、通氣。在海平面安靜狀態下，成年犬呼吸數為10～15次/min，脈搏數為70～80 次/min，犬正常心率為70～120次/min[7]。同樣體重的犬，每分鐘需要吸入的空氣量，海拔3000m時是平原的1.5倍，才能滿足身體對氧氣的需要，此時，犬會感到呼吸急促，如果加上運動，犬會通過增加呼吸頻率來適應地低氧環境。

5 犬在高原低氧環境下適應性的遺傳機制

氧是機體及細胞進行有效能量代謝不可缺少的物質，低氧使機體及細胞的生理發生改變，嚴重時可引起一系列的損傷和疾病。為適應低氧環境，生物經長期進化，已形成一套完整的氧感受機制及在不同氧化環境下的基因表達調控機制來適應低氧環境，達到生存目的。高原世居動物對低氧適應并不太依賴于器官功能的變化，更重要的是通過對細胞代謝的調整和許多抗低氧因子誘導從分子水平上來適應高原低氧環境。生物體對外界環境刺激作出反應，普通的機制是通過配體與受體結合，引發細胞內一系列生化級聯反應，最后調控相關基因表達的升高或降低，機體和細胞對低氧信號的識別及對基因表達的調控也遵循這一機制[8]。其中低氧誘導因子（Hypoxia inducible factor，HIF）是廣泛存在于人類與哺乳動物體內的一種非常重要的氧氣調節因子，在低氧條件下，可以調控許多與低氧應答相關的基因表達[9]，促進機體對低氧環境的適應，是低氧應答的全局性調控因子。HIF 是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體轉錄因子。α亞基共有3種亞單位，其中氧濃度主要通過對HIF1α和HIF2α的調節使其在低氧表達中扮演核心調控的作用[10]。在低氧狀態下，α亞基和β亞基組合成二聚體形式并且轉錄HIF調控的下游基因[11]，使其在生理上產生適應性的變化。目前對犬的高原適應性研究是通過全基因組測序的方法，最終確定了EPAS1和HBB基因是在高原犬在低氧適應性方面起重要作用的候選功能基因。

5.1 EPAS1基因對高原適應性的影響

EPAS1基因（Endothelial PAS domain protein 1，內皮細胞含PAS結構域蛋白-1），在家犬中編碼HIF2α蛋白，位于家犬第10號染色體Chr10：51，676，759-51，760，023，包含有個16外顯子和15個內含子，全長103.27kb，共轉錄2607bp堿基，編碼869個氨基酸。EPAS1為堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子超家族成員，并且具有PSA結構域，EPAS1在低氧條件下對系統的低氧應答起到至關重要的作用，是主要的低氧誘導因子之一[12-14]。

EPAS1主要表達于肺、胎盤和血管內皮細胞，由編碼的穩定性和轉錄活性由氧氣進行調節作用。常氧狀態下，位于HIF2α蛋白中的氧依賴降解結構域（oxygen dependent degradation domain，ODDD）與PHD蛋白（prolylhydroxylase domain，特定脯氨酸殘基被脯氨酰羥化酶結構域蛋白）發生羥化，使得HIF2α蛋白發生泛素化，最終被蛋白水解酶降解，因此HIF2α蛋白在細胞中含量保持很低的狀態。而當低氧時，PHD蛋白失去活性，ODDD結構域中的特定脯氨酸殘基不能發生羥化，HIF2α蛋白因不能被水解而含量增多，從而進入細胞核促進相關應對低氧的基因轉錄表達[15]。

5.2 HBB基因對高原適應性的影響

血紅蛋白β基因（Hemoglobinβ，HBB）又稱β珠蛋白基因。在家犬基因組上位于Chr21：31，299，273-31，306，907，由個3外顯子構成，全長7.57kb，共轉錄635bp堿基，編碼147個氨基酸。HBB基因編碼血紅蛋白中的β多肽鏈，與血紅素結合形成β -珠蛋白[16-18]。

在絕大多數的脊椎動物中，血紅蛋白分子是由4個珠蛋白亞基裝配組成。每個亞基則由一條肽鏈和一個亞鐵血紅素分子結合而成，肽鏈會以螺旋的形式盤旋成球形，將亞鐵血紅素分子結合在內將其環繞在內形成一個珠蛋白。HBB基因編碼的肽鏈組成β珠蛋白是構成血紅蛋白的重要組成因素。由于血紅蛋白在氧氣中運輸起重要作用，結構變異會直接導致其氧親和力變化，進而影響動物對低氧的適應。目前的研究認為HBB基因在功能上參與了氧從肺部輸送交換至全身各器官的重要功能。具有高氧親和力的血紅蛋白是高原動物適應低氧環境的最重要的特征之一[19]。在一些高原物種上的研究發現，發生在血紅蛋白鏈和鏈上的突變，會改變血紅蛋白與氧氣的親和力，從而對高原上的動物對氧氣的利用效率產生影響，這一例子已經在安第斯蜂鳥和高原鹿鼠上進行過研究報道[20-22]。

5.3 犬在高原低氧環境下適應性的遺傳機制

王國棟[23]等對犬在青藏高原低氧環境下適應性的研究發現通過等量混合樣品的全基因組重測序獲得240萬個SNP位點信息，再結合Fst檢驗、Fisher’s精確檢驗的嚴格篩選條件，最終有12個基因組區域的14個基因同時通過了兩個檢驗的篩選成為中國大陸家犬中最有可能受到高原適應性正選擇的基因。這其中內皮PAS結構域包含蛋白1基因（EPAS1基因）與血紅蛋白β基因（HBB基因）中包含有非同義突變，并且顯著性非常突出。為了進一步了解EPAS1基因的4個非同義突變等位基因頻率的情況，進行了擴展實驗，采集了61只只來自西藏的藏犬和149只來自低海拔地區的本地土狗進行SNP檢測，結果顯示位于EPAS1上的突變在藏犬中突變型等位基因頻率為95%，而在低海拔土狗中這一數值僅為4.9%。這些結果顯示EPAS1基因在青藏高原犬的高原適應性方面起到非常重要的作用。HBB基因的2個非同義突變等位基因頻率在藏犬中為86.4%，在低海拔土狗中僅為17.5%，突變型等位基因同樣表現出與高海拔群體的高度一致。

研究隨后擴大采樣地點和樣本量，在中國大陸地區的連續海拔梯度上共采集了17個地點一共511只中國本地土狗的樣本，這個地點遍布中國地區各省市，海拔梯度從海平面水平城市到青藏高原地區，覆蓋包括了低海拔地區，代表如廣州（海拔約50m、江西（約300m）、雅安（約600m）等，中等海拔地區如昆明（約1900m）、云南麗江（約2500m）、云南迪慶（約3400m）、甘肅甘南（約3600m）。以及高海拔地區如四川阿壩（約3700m）、青海玉樹（約4000m）、香格里拉（約4100m），西藏（約4100m）等。使用測序的方法，對EPAS1和HBB上6非同義突變點進行了檢測，對本地土狗進行等位基因頻率的分析研究，這些突變位點的等位基因頻率都呈現出隨著采樣地海拔的升高而上升的趨勢，突變型等位基因頻率與海拔呈現出極其顯著的正相關性。進一步在群體水平上證明了EPAS1基因與HBB基因在家犬高原適應性中起到非常重要的作用，并受到了正選擇的搭載效應的影響。

6 小結

高原低氧適應性的研究在生物學的各個領域，無論是從生理生化水平，遺傳機制水平或者是從進化等角度，都是近期的熱點研究問題。開展犬高原的低氧適應研究，可以為高原民族和高原動物、對前往高原地區的人員和動物的適應性和高原疾病研究提供生理和分子基礎資料。另一方面可以為快速、準確選育既高產又耐低氧的優良品種尋找低氧分子標記，開展適應高原低氧環境的定向品種培育；同時對高原動物特色基因的保存和利用及高原畜牧業的發展具有重要意義。

[1] CM Beall.Two Routes to Functional Adaptation：Tibetan and Andean High-Altitude Natives[J].Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，2007，104Suppl1（Suppl 1）：8655-8660.

[2] 杜振華，孔慶波，畢海龍.犬的高原反應及應對策略探討[J].中國工作犬業，2010，（6）：18-20.

[3] 王曉君，魏登邦，魏蓮，等.高原鼢鼠和高原鼠兔紅細胞低氧適應特征[J].四川動物，2008，27（2）：1100-1103.

[4] 蔡全林.西藏綿羊、山羊、黃牛、牦牛生理指標測定[J].中國獸醫雜志，1980，（2）：44-46.

[5] 顧為望，劉運忠，唐小江，等.西藏小型豬血液生理生化指標的初步研究[J].中國實驗動物學報，2007，15（1）：60-63.

[6] 樊若溪.青藏高原家犬的高原適應性遺傳機制[D].云南大學，2015.

[7] 金洪興.犬病的診斷技術[J].浙江畜牧獸醫，2000，25（2）：40.

[8] SemenzaG.Wang G.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site requiredfor transcription activation[J].Mol Cell Biol，1992，12 （12）：5447-5454.

[9] GL Semenza.Targeting HIF-1 for cancer therapy[J].Nature Reviews Cancer，2003，3（10）：721.

[10] Y oon D，Pastore Y D，Divoky V，et al．Hypoxia-inducible factor-1 deficiency results in dysregulated erythropoiesis signaling and iron homeostasis in mouse development[J].Journal of Biological Chemistry，2006，281（35）：25703-25711.

[11] Majmundar AJ，Wong WJ，Simon MC，et al．Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell，2010，40 （2）：294-309.

[12] HOCKEL M.SCHLENGER K.MITZE M，etal.Hypoxia and Radiation Response in Human Tumors[J].Seminars in radiation oncology，1996，6（1）：3-9.

[13] TINA H，HAMMER R E，MATSUMOTO A M，etal.The hypoxiaresponsive transcription factor EPAS1 is essential for catecholamine homeostasis and proection against heart failure during embryonic development[J].Genes &development，1998，12（21）：3320-3324.

[14] LEEFS，PERCYMJ.The HIF pathway and erythrocytosis[J].Annual review of pathology，2011，6（6）：165.

[15] S Jain，E Maltepe，MM Lu，et al，Gene expression pattern Expression of ARNT，ARNT2，HIF1a，HIF2a and Ah receptor mRNAs in the developing mouse[J].Seventeenth-Century French Studies，2012，34（2）：158-175.

[16] U Stelzl，U Worm，M Lalowski，et，al.A human protein-protein interaction network：a resource for annotating the proteome[J].Cell，2005，122（6）：957-968.

[17] B Shaanan. Structure of human oxyhaemoglobin at 2.1 A resolution[J]. Journal of Molecular Biology，1983，171（1）：31-59.

[18] R Campos，M Branco，S Weiss，N Ferrand.Patterns of hemoglobin polymorphism [α-globin（HBA）and β-globin（HBB）] across the contact zone of two distinct phylogeographic lineages of the European rabbit（Oryctolaguscuniculus）[M].Springer Netherlands，2007：237-255.

[19] 江炎庭，茍瀟，李明麗，等.高原民族和動物低氧適應血液生理特征及相關基因研究進展[J].中國畜牧獸醫，2012，39（10）：149-153.

[20] Projecto-Garcia J，Natarajan C，Moriyama H，et al. Storz. Repeated elevational transitions in hemoglobin function during the evolution of Andean hummingbirds[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（51）：20669-20674.

[21] Natarajan C，Inoguchi N，Weber R E，et al. Epistasis among adaptive mutations in deer mouse hemoglobin[J]. Science，2013，340 （6138）：1324.

[22] Storz J F，Runck A M，Moriyama H，et al. Genetic differences in hemoglobin function between highland and lowland deer mice[J]. Journal of Experimental Biology，2010，213（15）：2565-2574.

[23] Ruoxi，Hong，Shifang，Chunling，et.al.A Positive Correlation between Elevated Altitude and Frequency ofMutant Alleles at the EPAS1 and HBB Loci in Chinese Indigenous Dogs[J].Journal of Genetics and Genomics，2015，42（4）：173-177.

公安部科技強警基礎工作（基礎研究類）專項項目（2016GABJC38）

李靜（1989—），女，內蒙古烏蘭察布人，研究實習員，碩士，研究方向為警犬分子遺傳育種。陳超（1974-），男，內蒙古赤峰人，副研究員，碩士，研究方向為警犬疾病防治研究。

陳方良（1977—），男，云南陸良人，副研究員，碩士，研究方向為警犬疾病防治研究。