草果揮發油聯合環磷酰胺對肝癌細胞增殖的影響

時海榮，楊揚,2

(1桂林醫學院, 廣西桂林 541004;2廣西肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室)

·基礎研究·

草果揮發油聯合環磷酰胺對肝癌細胞增殖的影響

時海榮1，楊揚1,2

(1桂林醫學院, 廣西桂林 541004;2廣西肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室)

目的探討草果揮發油聯合環磷酰胺對人肝癌HepG2細胞增殖的影響。方法取對數生長期的HepG2細胞，隨機分為草果揮發油組、環磷酰胺組、聯合組及對照組，草果揮發油組加入不同濃度的草果揮發油(終濃度為10、20、30、40 μg/mL)，環磷酰胺組加入不同濃度的環磷酰胺(終濃度為10 、20 、40、60 、80 μg/mL)處理；聯合組加入不同濃度的草果揮發油(終濃度為10、20、30 、40 μg/mL)和環磷酰胺(終濃度為10 、20 、40 、60 、80 μg/mL)處理；對照組加入相應量的DMSO處理，采用MTT法測算各組細胞生長抑制率和協同指數(Q)。結果草果揮發油組、環磷酰胺組HepG2細胞增殖受到抑制，隨著作用濃度的升高，細胞生長抑制率增高，呈濃度依賴性；聯合組Q值≥0.85。結論草果揮發油在體外可發揮協同增強環磷酰胺抑制肝癌細胞增殖的作用。

肝癌；草果揮發油；環磷酰胺；細胞增殖

草果又名草果子、草果仁，為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果的干燥果實，是一種藥食同源植物，主要分布于我國廣西、四川、云南和貴州等地，其味辛，性溫，具有消食化積，祛痰截瘧，燥濕除寒等功效[1]。近年來多集中于對其揮發油提取方法、化學成分和生物活性的研究。研究者在分析草果揮發油成分組成的同時發現其具有抗菌、抗腫瘤作用，尤其是在體內外均能抑制肝癌細胞增殖[2～4]。環磷酰胺是常用的抗肝癌化療藥物，但由于耐藥性和不良反應，臨床應用受限。2016年6～12月，我們探討草果揮發油與環磷酰胺聯合用藥對人肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用，旨在探討草果揮發油對常用抗肝癌藥物的增敏效果，為草果揮發油進一步開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 草果揮發油由本實驗室提取純化；環磷酰胺(百靈威)；96孔板(JET-BIOFIL)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；鏈霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司)；人肝癌細胞系HepG2細胞株(由桂林醫學院藥理實驗室提供)；MTT粉末(Amresco)；二甲基亞砜(Amresco)；胰酶(吉諾生物醫藥技術有限公司)。酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Tek公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；CO2恒溫細胞培養箱(MCO-15AC日本三洋)；恒溫水浴鍋(金壇恒豐儀器廠)；潔凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥(重慶銀河試驗儀器有限公司)；微量振蕩器(江蘇泰縣醫療器械廠)。

1.2 細胞培養 HepG2細胞培養于含 10%胎牛血清，青霉素100 μg/mL 和鏈霉素100 μg/mL的DMEM高糖培養基中，于 37 ℃、5%CO2培養箱中靜置培養。待細胞生長至 80%～90%時常規消化傳代，每2～3 d傳代 1次，取對數生長期的細胞進行實驗[5]。

1.3 細胞形態觀察及細胞生長抑制率測算 采用MTT法。取對數生長期的HepG2細胞，經胰酶消化后制成單細胞懸液(濃度為5×104/mL)，將細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h。將HepG2細胞隨機分為草果揮發油組、環磷酰胺組、聯合組及對照組，草果揮發油組加入不同濃度的草果揮發油(終濃度為10、20、30、40 μg/mL)，環磷酰胺組加入不同濃度的環磷酰胺(終濃度為10 、20 、40、60 、80 μg/mL)處理；聯合組加入不同濃度的草果揮發油(終濃度為10、20、30 、40 μg/mL)和環磷酰胺(終濃度為10 、20 、40 、60 、80 μg/mL)處理；對照組加入相應量的DMSO處理[6]。培養24 h后鏡下觀察各組細胞形態后加入MTT(每孔20 μL)，4 h后，棄去原培養液，加入100 μL DMSO，置于微量振蕩器上振蕩10 min；于波長490 nm處測其吸光度(A)值，計算抑制率。每個濃度設3個復孔，重復 3 遍。細胞生長抑制率=[1- (實驗組平均A值-空白對照組A值)/(對照組平均A值-空白對照組A值) ]×100%[7]。根據實驗數據采用金正均法[8]計算兩藥協同作用的指數Q值，公式為：Q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，判斷兩藥相互作用的性質[9]。EA、EB為單獨用藥所得到的抑制率，EAB為聯合用藥所得到的抑制率。當0.85≤Q≤1.15時，兩藥聯用表現為簡單的相加作用；當Qgt;1.15時，聯合用藥具有協同作用；當Qlt;0.85時，聯合用藥表現為拮抗作用。

2 結果

2.1 細胞形態 細胞在未經藥物處理之前，呈長梭形貼壁生長。24 h后草果揮發油組、環磷酰胺組的細胞形態發生改變，數目減少，部分細胞呈球形，大小不等；24 h后聯合組的細胞數目劇減，細胞脫壁成懸浮狀，可見較多碎片及死亡細胞。

2.2 各組細胞生長抑制率比較 草果揮發油和環磷酰胺能在一定程度上抑制細胞增殖，且呈濃度依賴性。草果揮發油組10、20、30 、40 μg/mL草果揮發油處理HepG2細胞后細胞生長抑制率分別為6.3%±1.1%、22.8%±1.8%、35.0%±2.1%、41.0%±3.4%，與對照組比較,P均lt;0.05。環磷酰胺組10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后細胞生長抑制率分別為5.5%±0.9%、7.0%±1.2%、7.6%±0.8%、8.2%±1.0%、12.1%±1.6%，不同濃度間細胞生長抑制率與對照組比較,P均lt;0.05。聯合組10 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理后細胞生長抑制率分別為14.7%±0.7%、19.5%±1.2%、27.1%±1.5%、30.7%±2.1%、42.6%±2.4%，與草果揮發油組10 μg/mL草果揮發油作用后的細胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。聯合組20 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后細胞生長抑制率分別為25.2%±1.4%、27.2%±1.0%、33.6%±2.1%、39.4%±1.8%、54.2%±2.6%，40、60 、80 μg/mL環磷酰胺聯合作用后與草果揮發油組20 μg/mL草果揮發油作用后的細胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。聯合組30 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后細胞生長抑制率分別為34.2%±2.2%、36.7%±1.8%、43.5%±1.9%、50.2%±2.2%、54.9%±2.8%，60 、80 μg/mL環磷酰胺聯合作用后與草果揮發油組30 μg/mL草果揮發油作用后的細胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。聯合組40 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后細胞生長抑制率分別為46.3%±1.6%、48.9%±1.9%、51.2%±2.2%、51.7%±1.9%、55.7%±3.0%，與草果揮發油組40 μg/mL草果揮發油作用后的細胞生長抑制率比較，P均gt;0.05。聯合組與不同劑量環磷酰胺組細胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。

2.3 不同濃度的草果揮發油與不同濃度的環磷酰胺作用于HepG2細胞的Q值 聯合組10 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后Q值分別為1.29、1.52、2.02、2.20、2.41，聯合組20 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后Q值分別為0.93、0.97、1.17、1.36、1.69，聯合組30 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后Q值分別為0.85、0.88、1.02、1.16、1.17，合組40 μg/mL草果揮發油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環磷酰胺處理HepG2細胞后Q值分別為1.05、1.08、1.13、1.13、1.16。

3 討論

肝癌是一種臨床常見的耐藥惡性腫瘤[10]，在我國發病率居惡性腫瘤第3位，病死率居第2位[11]。目前化療是肝癌的主要治療手段，近年來醫藥學的發展使其治療效果不斷提高，但肝癌的病死率仍居高不下；而環磷酰胺是目前常用的肝癌化療藥物，但因其不良反應及耐藥性，臨床上用量和療效受限，因此尋求高效低毒的藥物及聯用藥物對降低不良反應和耐藥性，提高臨床療效有重要意義。

草果揮發油是從姜科豆蔻屬多年生藥食同源植物草果的干燥果實中提取出的有效組分，主要由1,8-桉葉素、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸香葉酯等單萜、倍半萜及其氧化物組成，在抗氧化、調節胃腸功能、抗菌、抗腫瘤及改變藥物通透性等方面發揮作用[1]。

本課題組前期研究已證實草果揮發油在體內外具有良好的抗肝癌活性，且毒性極低[3，4]。本實驗結果顯示草果揮發油和環磷酰胺聯合用藥比單用環磷酰胺對HepG2細胞生長的抑制作用更加明顯，兩者合用表現出化療協同或相加作用，無拮抗，且兩者在低濃度下便可達到理想的抗腫瘤效果，提示草果揮發油可以提高HepG2細胞對環磷酰胺的敏感性。此為草果揮發油抗腫瘤應用開發提供了更多的實驗依據和途徑，亦為腫瘤的臨床聯合治療拓展了思路。但本研究僅局限于體外試驗，其聯合抑制HepG2細胞增殖的機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.009

R735.7

A

1002-266X(2017)41-0031-03

國家自然科學基金地區基金項目(81560574)；廣西自然科學基金青年基金項目(2011GXNSFB018087, 2014GXNSFAA118235)；廣西教育廳項目(201010LX341)。

楊揚(E-mail:35112908@qq.com)

2017-04-20)