口蹄疫滅活疫苗146S含量檢測方法概述

董金杰 王 凡 陳苗苗 牟克斌 王超英 劉 萍*

（①中農威特生物科技股份有限公司 蘭州 730046 ①中國農業科學院蘭州獸醫研究所 蘭州）

口蹄疫滅活疫苗146S含量檢測方法概述

董金杰①①王 凡①陳苗苗①牟克斌①①王超英①①劉 萍①*

（①中農威特生物科技股份有限公司 蘭州 730046 ①中國農業科學院蘭州獸醫研究所 蘭州）

口蹄疫(Food and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Food and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的偶蹄類動物的急性、熱性、接觸性、烈性傳染病。世界范圍內預防口蹄疫發生的有效方法是疫苗免疫，疫苗生產過程中，各環節過程控制至關重要，其中準確定量完整的口蹄疫病毒粒子(146S)尤為關鍵，因為146S抗原的含量直接決定了口蹄疫滅活疫苗的質量，所以準確，快速，敏感的定量方法勢在必行，本文對146S含量檢測主要方法的研究進展做一綜述。

1 密度梯度離心法

主要有蔗糖密度梯度離心法和氯化銫密度梯度離心法兩種，其中蔗糖密度梯度離心法應用較為廣泛。

1.1 蔗糖密度梯度離心法 （1）該方法最早由Barteling等于1974年建，是采用10%～25%的蔗糖梯度，45000r/min離心30min，測定各部分在254nm處的吸光值，根據峰面積計算146S含量。但病毒液中146S含量太少時，不能直接檢測，需要用PEG-6000對樣品進行濃縮。最近幾年，很多研究人員對此方法進行了改進。董金杰等(2010)將滅活的FMDV經超濾濃縮后分別加于15%～45%和15%～55%的蔗糖梯度頂部，35000/min，超速離心2.5h后，用紫外分光檢測儀檢測各區帶在259nm處的吸光值，繪制吸收峰圖譜，并計算峰的面積從而得到146S抗原的含量。試驗結果表明，15%～45%的蔗糖梯度能較好的純化FMDV抗原，分離效果比15%～55%蔗糖梯度更為理想。因此15%～45%的蔗糖梯度更適合用于146S的定量檢測。盧永干等（2010）采用氯仿或三氯乙烯初步純化病毒液，超速離心對病毒液進行濃縮，15%～45%的蔗糖梯度離心進行病毒146S的定量。（2）兩種方法存在的缺點是：所需樣品量大，至少需10ml才能檢測；過程繁瑣，樣品必須經過濃縮步驟(超濾、沉淀和懸浮等過程)，抗原損失不確定，檢測結果不能反映真實值，導致重復性和穩定性差。往往在實驗室之間，人與人之間檢測結果變化率大。因此，董金杰等(2012)在原有的研究基礎上做了進一步改進，改進后無須將FMDV濃縮，可直接加FMDV于15%～45%的蔗糖梯度頂部，35000/min，超速離心3h后，用連續紫外檢測儀檢測各區帶在259nm處的吸光值，繪制吸收峰圖譜，通過計算吸收峰面積得出146S的含量。此方法的改進大大克服了樣品濃縮導致的周期長，樣品量大等缺點，同時結果的穩定性和重復性得到了保證，目前已在中農威特生物科技股份有限公司應用約兩年，檢測各類樣品8000余份次。實踐應用結果顯示，當樣品146S含量在1～15μg/ml時，相對偏差基本在5%以內，為中農威特生物科技股份有限公司指導疫苗生產、質量控制和濃縮純化工藝的開發和研究提供了技術支撐和保障。但此方法的局限是不能檢測多價成品疫苗中各血清型抗原的146S含量。

1.2 氯化銫密度梯度離心法 比蔗糖密度梯度離心法更為精確的測定146S含量的方法是通過氯化銫密度梯度離心定量分析，在每毫升微克量水平估測出146S抗原量，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測病毒抗原多肽的完整性以確定其質量。但因氯化銫價格較為昂貴，未被廣大科研工作者和疫苗生產廠家廣泛應用。

2 ELISA方法

（1）Crowther等(1979)是最早使用ELISA方法檢測和定量146S的，使用直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA方法同時定量FMDV，獲得很好的效果，三種方法的結果相同，靈敏度高，可檢測樣品含量在5～30ng/ml時的146S。在此基礎上，Abu Elzein等(1979)建立了一種夾心ELISA方法，使用的是豚鼠抗純化且滅活FMDV 146S的血清包被酶標板，加入待檢抗原，最后加入同源的酶標記的IgG，加入顯色底物，NaOH終止反應，酶標儀檢測OD405nm。在研究中發現，豚鼠抗純化且滅活FMDV146S的血清在免疫擴散試驗、補體結合試驗、雙抗體放射免疫試驗中與12S和146S都能發生反應，然而在此雙夾心ELISA試驗中該血清不與12S抗原發生反應，因此認為這種方法可以在有12S存在情況下特異性定量146S。（2）李樂等(2008)建立的ELISA的方法則是利用市場上現有的口蹄疫抗原捕獲ELISA試劑盒進行檢測，進行了146S抗原含量和ELISA結果的相關性研究，結果表明，抗原含量和OD450nm表示的ELISA結果有對數線性關系，相關系數為0.98。此方法與蔗糖密度超速離心方法定量比較，6個樣品檢測后，兩種方法檢測出的抗原含量差異在0.2～2.5μg/ml之間，且ELISA結果均高于蔗糖密度超速離心方法，由此可見兩種方法之間的檢測差異較大。Ouldridge等(1984)介紹了一種間接夾心ELISA專門用于定量收獲病毒液中的146S。多價兔血清用于包被微量滴定板，多價豚鼠血清用于試驗的第二相。建立的夾心ELISA方法不檢測12S抗原，因此適于定量146S抗原。但是，Van Mannen等(1990)發現這種ELISA方法既檢測12S也檢測146S，因此不適于定量146S，這與Ouldridge等的結果相反。（3）鑒于以上方法的局限性，因此進而發展出了有單克隆抗體參與的ELISA方法，Crowther等(1995)建立了一種雙抗體夾心ELISA方法，此方法使用的單克隆抗體為普通的抗FMDV單克隆抗體。該方法涉及使用了針對O型病毒VP1環狀區域的線性抗原表位的病毒中和性單抗隆抗體。在夾心ELISA中，這一單抗既被用作捕獲試劑也被用作檢測試劑。Crowther等建立的方法也是不檢測蛋白酶裂解過的146S。Yang等(2008)分離出了兩株抗FMDV的單克隆抗體，經試驗后發現這兩株單克隆抗體可用于定量疫苗生產過程中FMDV的146S含量。此方法在Pirbright疫苗研究中心測定疫苗生產過程中的146S含量受到廣泛的應用。雖然單克隆抗體ELISA方法具有較多的優點，但是制備單克隆抗體的過程較為復雜，而且ELISA方法檢測受到FMDV血清型和毒株的限制。一種單克隆抗體ELISA方法所能檢測的FMDV毒株的種類是有限的。

3 凝膠過濾色譜法

董金杰等(2007)利用Superose 6 HR柱(GE公司)對口蹄完整病毒進行分離純化，即將各種方法處理的BHK-21細胞口蹄疫病毒抗原制備物和陰性對照經氯仿去除大部分脂蛋白，再經Superose 6 HR一步柱層析純化，結合紫外(波長為254nm)檢測系統收集抗原峰，然后利用反向間接血凝試驗和感染性試驗檢測。結果顯示，Superose 6 HR柱對口蹄疫病毒的分離純化有一定效果，但根據陰性對照結果，抗原峰含有一部分水解乳蛋白和細胞成分；且經感染性檢測結合血凝試驗，抗原峰和后峰均含有完整病毒顆粒，徹底分離口蹄疫病毒較為困難，Marcelo等(2011)利用Sephacryl S-1000或S-400填料(G公司)分離純化并定量口蹄疫病毒完整粒子，原理是通過分子排阻色譜來分離疫苗混合物中的不同組分，將146S分離出來，在波長254nm下的光吸收值來測定146S含量，檢測范圍為5～70μg/ml。優點是適用于不同的口蹄疫毒株；使用標準的層析介質，可以自動化操作；純化后的樣品的檢測結果與蔗糖密度梯度離心分析法有良好的相關性。但未經純化的樣品檢測結果與蔗糖密度梯度離心分析法相關性如何，還需設立對照試驗進一步驗證。

4 熒光定量RT-PCR法

苗海生等（2013）利用口蹄疫146S抗原ELISA定量技術抗原含量關系的標準抗原作為對照，通過對口蹄疫病毒的RNA進行檢測，并進行待檢樣品與標準抗原曲線的對比，實現由病毒RNA熒光Ct值的測定向抗原含量的轉變。此過程整個操作過程僅需要2h，可迅速根據標準曲線判斷病毒懸液中病毒顆粒含量，節約生產成本。但本方法往往由于試劑、操作等因素的影響會產生一些誤差，并且受研究技術水平的限制，絕對定量的精度和準確性還有待進一步提高。

5 展望

上述幾種檢測方法各有利弊，蔗糖密度梯度離心法對FMDV的血清型毒株沒有限制，但無法檢測多價成品疫苗各血清型病毒的抗原含量；ELISA方法操作相對簡單，一次性可檢測大量樣品，但是制備單克隆抗體的過程復雜，并且對檢測的病毒株有限制；凝膠過濾色譜法則自動化程度高，操作相對簡單，但檢測靈敏度及對雜質含量較高的樣品分離效率目前不高，有待進一步的提高。

[1] Marcelo A S, Ignacio Fernandez, Erika S, et al．Foot and mouth disease(FMD) virus：quantification of whole virus Particles during the vaccine manufacturing process by size exclusion chromatograph[J].vaccine, 2011, 29: 7182-7187.

[2] 董金杰, 祁光宇, 劉學榮等. 用蔗糖密度梯度離心法檢測與定量口蹄疫病毒抗原[A]. 第三屆中國獸藥大會－獸醫生物制品學、獸醫微生物學學術論壇文集[C]. 2010.

[3] 董金杰, 劉學榮, 陳苗苗等. 凝膠過濾層析法純化口蹄疫病毒的試驗[J]. 中國獸醫科學增刊, 2007.

[4] Junsuke SHIRAI, Arinee CHATCHAWANCHONTEERA, et al.Estimation of 140S Particles in Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)Vaccine by Using the computer Analyzing System. Jpn J Vet Sci, 1990,52(3): 621-630.

[5] Bartelingm, S. J. and Meloen, R. H. A simple method for the quantification of 140S particles of foot-and-mouth disease virus(FMDV).Arch Gesamte Virusforsch, 1974, 45: 362-364.

[6.李樂, 苗海生, 信愛國等. ELISA用于口蹄疫病毒146S抗原快速定量的研究[J]. 中國預防獸醫學報, 2008, 30(4): 314-317.

S852.4+3

A

1007-1733(2017)10-0078-02

甘肅省科技支撐計劃項目(1104NKCA081)

*通訊作者，

2017–05–11）