豬流感病毒HA基因研究進展

孫法超 張元超 王玉超 肖一紅

（山東農業大學動物科技學院 山東 泰安 271018）

豬流感病毒HA基因研究進展

孫法超 張元超 王玉超 肖一紅

（山東農業大學動物科技學院 山東 泰安 271018）

豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸系統疾病。極易繼發感染其他病，像一些細菌，病毒和寄生蟲病等。使得病情更加復雜，從而提高了病豬的死亡率，給養殖業造成了巨大的經濟損失。血凝素(HA)基因是流感病毒表面的主要抗原基因，變異頻率很高，是病毒發生抗原變異的主要原因。HA與流感病毒感染的宿主范圍和致病力密切相關，同時還能誘導機體產生中和抗體，是流感病毒最重要的一個蛋白。因此，本文對豬流感病毒的HA基因進行了綜述，為進一步對豬場的流感防治以及疫苗研發提供理論依據。

2016YFD0500201 國家重點研發計劃

豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)屬于正粘病毒科，A型流感病毒屬，是一種單股負鏈RNA病毒。豬流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一種急性、熱性、傳染性呼吸系統疾病。該病的發生無明顯的季節性，但在春秋和冬季，尤其季節交替時易發，易感豬群不分年齡、性別和品種，臨床癥狀主要表現為食欲下降，精神沉郁、體溫升高、呼吸困難、咳嗽以及流涕等。20世紀30年代Shope從豬的體內第一次分離到了一株H1N1亞型豬流感病毒，因此由該病毒引起的豬的疾病稱為SI[1-3]，之后全球范圍內均出現過相關的報道。另外，由于人的流感病毒和禽的流感病毒的受體同時存在于豬體內，因此認為豬是人、禽和豬流感病毒通過基因重排并產生新的病毒的“混合器”(Ito et al. 1998；Karasin et al.2006；Thacker et al.2008；Naffakh et al.2009)。當前已經發現的SIV有很多種，包括H1N1、H1N2、H2N3(Ma et al.2007)、H3N1(Lekcharoensuk et al.2006)、H3N2、H3N3(Karasin et al.2004)H3N6、H4N6、H5N1(Lvov et al.2006)和H7N9(Hai et al.2008)等多種不同的亞型。在全球范圍內當前的流行毒株以H1N1、H1N2和H3N2為主。SIV的基因組由8個大小不等的獨立片段構成，3種多聚酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、基質蛋白(M1和M2)、血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)、核輸出蛋白(NEP)和非結構蛋白(NS1和NS2)共11個蛋白。HA是一種主要的糖蛋白，該蛋白有以下幾個主要功能：能夠刺激機體，誘導機體產生中和性抗體；可以識別并結合宿主細胞表面的特異性受體；參與流感病毒囊膜與核內膜的融合。所以，對于HA基因的研究還是具有重要意義的。

1 HA基因的特點

流感病毒的基因由八個單鏈RNA組成，通過對絕大多數流感病毒的全基因序列進行測序，以及序列的比對，發現所有片段中，5′端的前13個核苷酸相同，均為GGAACAAAGAUGAppp5′；3′前12個核苷酸也相同，為3′HO-UGGU/CUUUCGUCC;每個序列都有Polyu保守區，位于每個序列的5′端第15至21核苷酸處，其主要功能是利用病毒mRNA的合成時生成的PolyA信號來終止病毒mRNA的合成。流感病毒RNA片段4編碼HA，HA編碼566個氨基酸，大小為75kD。HA基因的亞型較多，很容易發生變異，A型流感病毒亞型的劃分可以依據HA基因及其蛋白的抗原特性。(Lind-strom et al.1998)。

2 HA蛋白的特點以及功能

（1）作為流感病毒中的重要蛋白，HA蛋白分子有信號肽、胞漿域、跨膜域以及胞外域這幾個結構域。HA的糖基化位點一般有6～10個[4]。HA要發揮作用，需要經過裂解酶的裂解，糖基化和脂肪酸的乙酰化這幾個加工處理過程。此外，HA水解后可分成兩部分：HA1和HA2，前者氨基酸殘基有319～328個，后者為221～222個。兩者之間以1個精氨酸相連。HA1可以與宿主細胞的受體進行結合；其功能主要是使病毒與宿主細胞表面的唾液酸受體結合，之后等病毒吸附后，宿主細胞會通過內吞作用使病毒粒子進入。HA2主要參與細胞的融合。HA水解是流感病毒感染的先決條件[5-8]。此外，病毒的致病性也與HA糖基化位點和裂解位點處堿性氨基酸的變化有關。（2）對于HA的蛋白表達，張祥斌等（2008）用pBCX高效可溶表達載體成功表達了H1N1亞型的蛋白，隨后又通過Westernblot實驗證實了可溶表達的融合蛋白對H1N1亞型豬流感病毒陽性血清具有良好的免疫原性，并且最后篩選到的兩株針對HA蛋白抗原表位的單克隆抗體就是用此蛋白作為抗原的。

3 HA基因工程疫苗

基因工程疫苗中研究較多的是HA蛋白基因，主要是HA蛋白相比其他蛋白有著較好的免疫原性，以下幾種疫苗在豬流感中較為常用：

3.1 重組活載體疫苗 豬流感病毒重組活載體疫苗是將HA或者NA基因插入到已知的病毒活載體中致使基因獲得高效表達。這種疫苗有著較多的優點，一方面是接種后不受母源抗體的影響，其他疫苗的部分缺點得到改進，另一方面是只需接種少量疫苗就可以產生較多的外源蛋白(Kitikoon et al. 2006)。對于豬流感H3N2疫苗的的獲得，國內學者周國輝等(2005)曾把偽狂犬疫苗毒株Bartha-K61的基因組與含有H3N2豬流感HA基因的轉移載體pLTK-HA共轉染Vero細胞，并成功得到了重組偽狂犬病病毒，隨后對其免疫保護效果進行測試，結果較為理想。所以，重組活載體HA疫苗具有較好的免疫活性。

3.2 亞單位疫苗 目前亞單位疫苗的制作主要是提取的一些病原體的免疫原蛋白，之后再對有免疫活性的片段篩選。亞單位疫苗由于其主要表面蛋白質種類少，致使一些無關抗原誘發抗體的產生得到了避免，所以疫苗本身的副作用也相應地減少了。在基因工程中可以通過DNA重組技術把HA基因連接到載體質粒，之后再導入表達系統中進行擴增表達，此種方法的生產成本較低，而且還可以得到較多的HA蛋白。該種亞單位疫苗可以免疫保護多種H亞型毒株(Ste-phenson et al.2004）)。盡管亞單位疫苗在應用上有著一些不錯的特點，但是在生產過程中也存在很多問題，所以對于亞單位疫苗的生產研究條件還需進一步的優化。

3.3 DNA疫苗 豬流感DNA疫苗的制作主要是將該病毒主要免疫原基因HA或NA插入到真核表達質粒中，然后將該重組質粒導入機體細胞，最后誘導機體產生特異性免疫應答。(Larsen etal .2001)曾對豬用表達的HA的DNA疫苗進行免疫，然后在初免過后四周，又用滅火苗進行加強免疫了一次，與此同時，和只進行DNA疫苗接種的兩次進行比較，發現前者產生的抗體水平更高。(Ljungberg et al.2002)也曾構建了嵌合HA質粒，他用的兩株A型流感毒株在遺傳學和血清學上是不相同的，構建完成后疫苗接種了24只成年雪貂，最后對雪貂體內的抗體經和HI和ELISA進行檢測，構建的嵌合質粒對小鼠有較高的抗體滴度。因此與傳統疫苗相比可以看出，該種疫苗總的來說可以產生一定的免疫保護力，但重復性與免疫效果還是不太理想，所以對該種疫苗的研究還有待提高。

4 結語

豬流感病毒在我國豬群中廣泛存在，給我國養殖業帶來了巨大的經濟損失。為防治豬流感，減輕損失，對該病的疫苗研究是必要的。HA基因是豬流感病毒中重要的基因，對該基因以及蛋白的研究可以為新型豬流感病毒疫苗的開發提供理論基礎，所以筆者對于該病防治還是充滿了信心。

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