檸檬精油對變異鏈球菌及白假絲酵母菌生長及牙菌斑生物膜形成的抑制作用

王小玉，王玉芝，馬麗，張向宇

(天津醫科大學口腔醫學院，天津 300070)

檸檬精油對變異鏈球菌及白假絲酵母菌生長及牙菌斑生物膜形成的抑制作用

王小玉，王玉芝，馬麗，張向宇

(天津醫科大學口腔醫學院，天津 300070)

目的 探討檸檬精油對變異鏈球菌及白假絲酵母菌生長及牙菌斑生物膜形成的抑制作用。方法 采用MTT藥敏試驗檢測不同濃度檸檬精油作用后變異鏈球菌和白假絲酵母菌的存活率，并記錄最低抑菌濃度。將離體牙片置入無菌唾液中，形成獲得性膜后，放入變異鏈球菌或白假絲酵母菌懸液中培養。取出牙片，經不同濃度檸檬精油處理(變異鏈球菌作用后的牙片檸檬精油濃度分別為0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL，白假絲酵母菌作用后的牙片檸檬精油濃度分別為1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL)，以不含檸檬精油的帶菌培養基為陽性對照，記錄洗脫液中的菌落數。結果 隨著檸檬精油濃度的升高，變異鏈球菌、白假絲酵母菌的存活率均逐漸降低。檸檬精油對變異鏈球菌的最低抑菌濃度為0.563 mg/mL，對白假絲酵母菌的最低抑菌濃度為1.125 mg/mL。經0.563、0.281、0.141 mg/mL檸檬精油作用后變異鏈球菌洗脫液菌落數均低于陽性對照，經1.125、0.563、0.281 mg/mL檸檬精油作用后白假絲酵母菌洗脫液菌落數均低于陽性對照(P均<0.05)。結論 檸檬精油可抑制變異鏈球菌及白假絲酵菌的生長；檸檬精油亞抑菌濃度即可抑制變異鏈球菌及白假絲酵母菌在離體牙表面上形成生物膜。

低齡兒童齲；變異鏈球菌；白假絲酵母菌；生物膜；最低抑菌濃度

低齡兒童齲(ECC)的特點是齲壞進展快、范圍廣，可對兒童的口腔健康產生嚴重不良影響[1]。變異鏈球菌與白假絲酵母菌是導致ECC的關鍵細菌[1～3]。牙菌斑生物膜是致齲的關鍵因素，其在獲得性膜形成后，可與細菌表面的受體結合，抵抗藥物的滲透作用，還可增強微生物對牙釉質的黏附作用。本課題組前期研究發現，檸檬精油可抑制多種牙周致病菌的生長，如變異鏈球菌、血鏈球菌、遠緣鏈球菌等，在亞抑菌濃度(即低于最低抑菌濃度)下即可降低細菌產酸及多種黏附基因的表達[4,5]。2014年1月～2016年6月，本研究觀察了檸檬精油對變異鏈球菌及白假絲酵母菌生長及牙菌斑生物膜形成的影響。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株：變異鏈球菌ATCC25923、白假絲酵母菌ATCC10261均由天津醫科大學基礎醫學院微生物教研室提供。檸檬精油：采用水蒸氣蒸餾法提取。取新鮮檸檬果皮剪切成5 mm×5 mm大小，置于圓底燒瓶中，加入適量水，加熱回流40 min，提取收集檸檬精油。離體牙磨片：取正畸拔除的無齲壞雙尖牙，常規洗滌，超聲清洗后高壓消毒，去除牙根后沿近遠中徑剖成兩半；體視顯微鏡下觀察無缺損、裂痕，制成5 mm×5 mm×3 mm大小的釉質牙片，分級拋光備用。主要試劑：PBS、沙氏液體培養基均購于天津瑞泰科技發展有限公司，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基購于北京陸橋技術股份有限公司，血瓊脂培養基購于天津醫科大學醫學檢驗制品廠，二甲基亞砜購于天津市光復精細化工研究所，MTT溶液購于美國Sigma公司。

1.2 檸檬精油抑制變異鏈球菌及白假絲酵母菌生長的觀察

1.2.1 變異鏈球菌、白假絲酵母菌懸液制備及培養 變異鏈球菌復蘇48 h，于37 ℃條件下厭氧環境(20% CO2、80% N2)中采用TSB固體培養基培養24 h。白假絲酵母菌采用沙氏液體培養基復蘇48 h，37 ℃恒溫箱培養24 h。涂片檢查兩種細菌均為純培養后，分別將菌液置于離心機上，3 000 r/min離心5 min，PBS漂洗3次，制備菌懸液，密度均為1×108個/mL。

1.2.2 檸檬精油對變異鏈球菌、白假絲酵母菌存活率的影響及其最低抑菌濃度 采用MTT藥敏試驗。將檸檬精油分別用沙氏液體培養基及TPY培養基從9 mg/mL(體積比為1∶100)進行二倍稀釋，使其終濃度為9、4.5、2.25、1.125、0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL。分別取不同濃度檸檬精油稀釋液50 μL置入96孔板，加入50 μL變異鏈球菌或白假絲酵母菌懸液，混勻，37 ℃恒溫箱內培養24 h；加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續培養4 h；加入二甲基亞砜20 μL，搖勻，記錄酶標儀570 nm波長處的光密度(OD)值。以含菌的培養基作為陽性對照，含等量檸檬精油的培養基為空白對照。每個濃度重復4次，取平均值。存活率=(實驗孔OD值-空白對照孔OD值)/(陽性對照孔OD值-空白對照孔OD值)×100%。變異鏈球菌、白假絲酵母菌存活率<30%時的檸檬精油濃度，即最低抑菌濃度。

1.3 檸檬精油抑制變異鏈球菌及白假絲酵母菌生物膜形成的觀察

1.3.1 離體牙片處理 選擇口腔健康、無牙周疾病及齲齒的在校小學生1例，分別取其進食、刷牙2 h后非刺激性全唾液，10 000 r/min離心5 min，取上清液。高溫消毒，涂片檢查確定無菌后備用。取無菌的24孔聚苯乙烯酶標板，每孔置入離體牙片，加入1 mL無菌唾液，室溫條件下75 r/5 min搖床培養1.5 h；吸出唾液，形成獲得性膜，PBS漂洗備用。

1.3.2 檸檬精油作用后牙片菌落數及黏附率 將經過唾液處理后的離體牙片放入2 mL含有2.5%葡萄糖的變異鏈球菌懸液中(菌懸液密度為1×107個/mL) ，75 r/5 min搖床培養16.5 h，移除培養基，PBS漂洗去除非黏附細菌，置入新鮮培養基內；每24 h更換一次培養基，培養至72 h。根據1.2.2中變異鏈球菌的最低抑菌濃度，將離體牙片分別放入0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL檸檬精油中作用3 min，陽性對照中加入不含檸檬精油的帶菌培養基。PBS漂洗離體牙片后繼續放入培養基中培養，每4 h作用1次，共作用3次，最后置于新鮮培養基中培養16 h[3，6]。參照上法，將唾液處理后的離體牙片放入白假絲酵母菌懸液中培養后，再分別經1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL檸檬精油處理，余操作同變異鏈球菌。取出離體牙片，放入PBS中震蕩漂洗2 min，取10 μL洗脫液均勻涂布于固體培養基中，然后進行菌落計數。采用分光光度計測量570 nm波長下洗脫液與原培養液的OD值。每個濃度重復5次，取平均值。黏附率=洗脫液OD值/(洗脫液OD值+原培養液OD值)×100%。

2 結果

2.1 細菌存活率及檸檬精油最低抑菌濃度 經9、4.5、2.25、1.125、0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL檸檬精油作用，變異鏈球菌的存活率分別為0.1%、17.2%、18.6%、20.5%、29.9%、43.0%、90.6%、100%，白假絲酵母菌的存活率分別為15.0%、18.2%、21.7%、25.3%、60.5%、63.4%、89.4%、92.6%。檸檬精油對變異鏈球菌的最低抑菌濃度為0.563 mg/mL，對白假絲酵母菌的最低抑菌濃度為1.125 mg/mL。

2.2 洗脫液菌落數 經0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL檸檬精油處理，變異鏈球菌的洗脫液菌落數分別為(29.00±19.80)、(102.75±11.53)、(119.75±30.60)、(199.75±24.98)個，陽性對照孔為(304.00±89.56)個；0.563、0.281、0.141 mg/mL檸檬精油作用后變異鏈球菌的洗脫液菌落數均低于陽性對照孔(P均<0.05)。經1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL檸檬精油處理，白假絲酵母菌的洗脫液菌落數分別為(68.00±11.49)、(80.00±12.36)、(106.00±29.81)、(136.75±26.47)個，陽性對照孔為(172.75±15.69)個；1.125、0.563、0.281 mg/mL檸檬精油作用后白假絲酵母菌的洗脫液菌落數均低于陽性對照孔(P均<0.05)。

2.3 黏附率 經0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL檸檬精油處理，變異鏈球菌的黏附率分別為45.2%、47.5%、48.2%、50.6%，陽性對照孔為51.9%；兩兩比較P均>0.05。經1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL檸檬精油處理，白假絲酵母菌的黏附率分別為45.2%、74.5%、79.8%、80.8%，陽性對照孔為82.2%；1.125 mg/mL檸檬精油作用后白假絲酵母菌的黏附率均低于其他濃度及陽性對照孔(P均<0.05)。

3 討論

白假絲酵母菌對牙齒及牙周組織有極強的黏附作用，而且其耐酸性及產酸能力強，可顯著降低釉質硬度并降解膠原Ⅰ，造成牙本質塌陷，以上因素共同作用導致其致齲能力較強[6～11]。變異鏈球菌與白假絲酵母菌通過葡糖基轉移酶-B(GtfB)相互連接，聚集形成菌斑生物膜，而白假絲酵母菌與GtfB的黏附力是變異鏈球菌的20倍，具有更高的穩定性[8]。研究顯示，兩菌混合培養的產酸量明顯高于變異鏈球菌單獨培養，pH進一步降低，更有利于齲病的發展[12]。

近年研究發現，香茅和肉桂精油有抑制義齒材料表面白假絲酵母菌生長及黏附作用，黃岑素及倒捻子素等也有類似的抑制效果[13,14]。但香茅及肉桂精油作用時間短，無法長期抑制牙菌斑生物膜的形成；而黃岑的具體藥理機制目前尚不清楚，且容易導致消化系統不良反應。檸檬精油是從檸檬果皮中提取的芳香類化合物，是食品級天然原料，取材簡單，不良反應少，氣味宜人。本課題組前期研究發現，檸檬精油可抑制變異鏈球菌在光滑玻璃片的黏附，低于最低抑菌濃度時即可抑制變異鏈球菌致齲基因的表達，還可降低細胞外多糖合成[15]，證實其具有防齲潛能。本研究結果顯示，隨著檸檬精油濃度的升高，變異鏈球菌、白假絲酵母菌的存活率均逐漸降低，說明檸檬精油可抑制變異鏈球菌、白假絲酵母菌的生長；1.125 mg/mL的檸檬精油即可使白假絲酵母菌達到最低抑菌濃度，0.563 mg/mL的檸檬精油即可使變異鏈球菌達到最低抑菌濃度。

牙菌斑生物膜是致齲的關鍵因素，其形成需要經過獲得性膜形成和初期聚集、細菌迅速生長和繁殖、菌斑成熟三個階段。獲得性膜可與細菌表面的受體結合，抵抗藥物的滲透作用，還可增強微生物對牙釉質的黏附作用。本研究為模擬人的口腔衛生習慣，每4 h用檸檬精油處理離體牙1次，每次3 min，模仿刷牙、漱口的時間間隔。結果顯示，0.563、0.281、0.141 mg/mL檸檬精油作用后變異鏈球菌的洗脫液菌落數均低于陽性對照，1.125、0.563、0.281 mg/mL檸檬精油作用后白假絲酵母菌的洗脫液菌落數均低于陽性對照；說明亞抑菌濃度的檸檬精油對變異鏈球菌和白假絲酵母菌的生物膜仍有抑制作用；也表明在不殺滅細菌與真菌的情況下，檸檬精油可抑制變異鏈球菌、白假絲酵母菌的生物膜對牙面的黏附，在較低的濃度下即可抑制細菌和真菌的生長，保護菌群之間的微生態平衡。本研究不同濃度檸檬精油處理后變異鏈球菌的黏附率無明顯變化，經1.125 mg/mL檸檬精油作用后白假絲酵母菌的黏附率均低于其他濃度及陽性對照，與本課題組前期在光滑聚苯乙烯平板上的結果不同，可能與生物膜降低檸檬精油對變異鏈球菌黏附的抑制作用有關。檸檬精油對變異鏈球菌的抑制作用可能與降低其疏水性、減少自由基產生及降低產酸作用有關[16,17]，但其抑制白假絲酵母菌生長的具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，檸檬精油可抑制變異鏈球菌及白假絲酵菌生長；檸檬精油亞抑菌濃度即可抑制變異鏈球菌及白假絲酵母菌在離體牙表面上形成生物膜。

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張向宇(E-mail： xzhang04@tmu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.014

R781.1

A

1002-266X(2017)08-0047-03

2016-07-26)